摘要

精子(zi)(zi)結合蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)（BSP）是牛精漿(jiang)中的(de)(de)(de)(de)(de)主要蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)，已知(zhi)其部分(fen)插入精子(zi)(zi)膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)外小葉，并與(yu)(yu)(yu)其中存在(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)含(han)膽(dan)堿(jian)(jian)脂(zhi)(zhi)質(zhi)結合。這種插入通過誘導精子(zi)(zi)早期獲能，對冷凍(dong)保存后的(de)(de)(de)(de)(de)精液質(zhi)量產生(sheng)負面(mian)影響。BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)表面(mian)性(xing)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)假(jia)設(she)通過張力測定法進(jin)行了驗(yan)證(zheng)：BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)具有高度的(de)(de)(de)(de)(de)表面(mian)活(huo)性(xing)。這表明BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)不僅(jin)通過相(xiang)互之間的(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)互作用，而(er)且由于其自身的(de)(de)(de)(de)(de)表面(mian)活(huo)性(xing)，能夠到達(da)磷脂(zhi)(zhi)覆蓋的(de)(de)(de)(de)(de)界(jie)面(mian)。BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)插入精子(zi)(zi)外小葉的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)結構(gou)域是在(zai)類(lei)似Langmuir單(dan)(dan)分(fen)子(zi)(zi)膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)仿(fang)生(sheng)系(xi)統上復制的(de)(de)(de)(de)(de)。BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)(de)插入可(ke)以在(zai)含(han)有膽(dan)堿(jian)(jian)脂(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)壓縮流體(ti)域中進(jin)行。單(dan)(dan)層膜(mo)(mo)也被(bei)用來研(yan)究BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)與(yu)(yu)(yu)兩種磷脂(zhi)(zhi)組裝(zhuang)物的(de)(de)(de)(de)(de)絡(luo)合作用：蛋(dan)(dan)(dan)(dan)黃低密度脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)（LDL）或雞(ji)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)磷脂(zhi)(zhi)脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)。無論磷脂(zhi)(zhi)結構(gou)（脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)或脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)）如何，BSP都不能改變(bian)膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)結構(gou)。只(zhi)有BSP蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)與(yu)(yu)(yu)磷脂(zhi)(zhi)酰(xian)膽(dan)堿(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)總比例是重要的(de)(de)(de)(de)(de)。這兩種螯合劑的(de)(de)(de)(de)(de)區別在(zai)于它(ta)們(men)的(de)(de)(de)(de)(de)表面(mian)性(xing)質(zhi)：LDL有很(hen)強的(de)(de)(de)(de)(de)與(yu)(yu)(yu)外層結合的(de)(de)(de)(de)(de)傾向，而(er)脂(zhi)(zhi)質(zhi)體(ti)主要以相(xiang)同的(de)(de)(de)(de)(de)時(shi)間尺度保持在(zai)本體(ti)中。

1、介紹

精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)結(jie)(jie)(jie)(jie)合(he)蛋白(bai)(bai)(bai)（BSP）是(shi)一(yi)個已知在(zai)輸卵管精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)儲(chu)存(cun)(cun)庫的(de)(de)(de)形成(cheng)和(he)(he)(he)(he)精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)獲(huo)能(neng)中(zhong)起作用(yong)的(de)(de)(de)蛋白(bai)(bai)(bai)質(zhi)家(jia)族，精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)成(cheng)熟是(shi)受精(jing)(jing)(jing)(jing)的(de)(de)(de)關鍵步驟[1,2]。在(zai)牛精(jing)(jing)(jing)(jing)漿中(zhong)，根(gen)據Manjunath等(deng)人的(de)(de)(de)命名法[2]：BSP1[4]、BSP3[5]和(he)(he)(he)(he)BSP5[6,7]分(fen)別鑒(jian)定和(he)(he)(he)(he)分(fen)類了三種比例為(wei)10:1:1的(de)(de)(de)主要(yao)BSP蛋白(bai)(bai)(bai)[3]。BSP1和(he)(he)(he)(he)BSP3的(de)(de)(de)表(biao)觀(guan)質(zhi)量為(wei)15–16.5 kDa，BSP5的(de)(de)(de)表(biao)觀(guan)質(zhi)量為(wei)28–30 kDa[6,8]。這(zhe)三種蛋白(bai)(bai)(bai)質(zhi)由(you)一(yi)個獨(du)特(te)的(de)(de)(de)N端結(jie)(jie)(jie)(jie)構(gou)域和(he)(he)(he)(he)兩個纖(xian)維連接蛋白(bai)(bai)(bai)II型(xing)結(jie)(jie)(jie)(jie)構(gou)域組成(cheng)。只有(you)(you)三種BSP蛋白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)N端結(jie)(jie)(jie)(jie)構(gou)域存(cun)(cun)在(zai)顯著差異[4–6]。每個纖(xian)維連接蛋白(bai)(bai)(bai)II型(xing)結(jie)(jie)(jie)(jie)構(gou)域包含(han)一(yi)個磷(lin)酰膽堿(jian)結(jie)(jie)(jie)(jie)合(he)位點(dian)[9–14]。最后這(zhe)些是(shi)BSP蛋白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)生物學(xue)作用(yong)所必需的(de)(de)(de)。事實上(shang)，精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)膜的(de)(de)(de)外小葉在(zai)射精(jing)(jing)(jing)(jing)過(guo)程中(zhong)與含(han)有(you)(you)BSP蛋白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)(de)精(jing)(jing)(jing)(jing)漿接觸[2,15]。BSP蛋白(bai)(bai)(bai)與精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)膜上(shang)的(de)(de)(de)含(han)膽堿(jian)磷(lin)脂(zhi)（如磷(lin)脂(zhi)酰膽堿(jian)和(he)(he)(he)(he)鞘磷(lin)脂(zhi)）快速結(jie)(jie)(jie)(jie)合(he)[9,12,16–19]，并通過(guo)部分(fen)插入精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)質(zhi)膜的(de)(de)(de)外小葉[1,13,20]覆蓋精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)表(biao)面。這(zhe)是(shi)通向輸卵管精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)儲(chu)存(cun)(cun)庫和(he)(he)(he)(he)精(jing)(jing)(jing)(jing)子(zi)(zi)獲(huo)能(neng)的(de)(de)(de)第一(yi)個關鍵步驟。BSP蛋白(bai)(bai)(bai)既可溶又能(neng)插入疏水膜的(de)(de)(de)事實證明BSP蛋白(bai)(bai)(bai)具有(you)(you)兩親性。因此，本(ben)研究的(de)(de)(de)第一(yi)部分(fen)旨在(zai)通過(guo)進行(xing)張力測量來(lai)檢驗這(zhe)一(yi)假設(she)。

BSP蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)誘(you)導(dao)的(de)(de)(de)(de)早期獲能[21,22]對冷凍保存(cun)后(hou)的(de)(de)(de)(de)精(jing)(jing)液質(zhi)(zhi)(zhi)量有負面(mian)影響(xiang)，因(yin)為它會導(dao)致抗冷性(xing)和(he)(he)(he)抗凍性(xing)的(de)(de)(de)(de)喪(sang)失[12,17,23–25]。因(yin)此，保護器的(de)(de)(de)(de)存(cun)在(zai)對維持精(jing)(jing)子質(zhi)(zhi)(zhi)量至(zhi)關重要。蛋(dan)(dan)黃(huang)被廣泛用(yong)(yong)于(yu)(yu)分離(li)BSP蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)[17,26–32]。這(zhe)種(zhong)隔離(li)是由(you)于(yu)(yu)蛋(dan)(dan)黃(huang)中(zhong)存(cun)在(zai)的(de)(de)(de)(de)低(di)密(mi)(mi)度脂(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)（LDL）外(wai)層(ceng)(ceng)(ceng)的(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)脂(zhi)酰膽堿與(yu)(yu)BSP蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)之間(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)特異性(xing)和(he)(he)(he)強相(xiang)(xiang)互作(zuo)用(yong)(yong)[9,12,33,34]。在(zai)某些情(qing)(qing)況下(xia)(xia)，還假設低(di)密(mi)(mi)度脂(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)對精(jing)(jing)子早期獲能的(de)(de)(de)(de)保護作(zuo)用(yong)(yong)是由(you)于(yu)(yu)富含磷(lin)(lin)脂(zhi)的(de)(de)(de)(de)低(di)密(mi)(mi)度脂(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)極(ji)性(xing)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)與(yu)(yu)由(you)于(yu)(yu)外(wai)排而減少的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)和(he)(he)(he)膽固醇的(de)(de)(de)(de)精(jing)(jing)子膜(mo)之間(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)交(jiao)換[29]。目前，大(da)豆卵磷(lin)(lin)脂(zhi)等其他磷(lin)(lin)脂(zhi)被用(yong)(yong)作(zuo)蛋(dan)(dan)黃(huang)磷(lin)(lin)脂(zhi)的(de)(de)(de)(de)替代品。然而，在(zai)這(zhe)種(zhong)情(qing)(qing)況下(xia)(xia)，脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)和(he)(he)(he)膜(mo)之間(jian)(jian)可能的(de)(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)互作(zuo)用(yong)(yong)尚不清楚。因(yin)此，本研究的(de)(de)(de)(de)第二(er)(er)(er)部(bu)分旨在(zai)比(bi)較低(di)密(mi)(mi)度脂(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)和(he)(he)(he)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)與(yu)(yu)脂(zhi)膜(mo)接觸的(de)(de)(de)(de)行(xing)為。為此，在(zai)空(kong)氣-緩沖(chong)液界面(mian)上的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)單(dan)層(ceng)(ceng)(ceng)被用(yong)(yong)來(lai)模擬精(jing)(jing)子膜(mo)外(wai)小(xiao)葉的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)結(jie)構(gou)(gou)域。這(zhe)種(zhong)方法被證明(ming)能有效地復制牛精(jing)(jing)子膜(mo)外(wai)小(xiao)葉脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)結(jie)構(gou)(gou)域的(de)(de)(de)(de)異質(zhi)(zhi)(zhi)結(jie)構(gou)(gou)域[35]。最(zui)后(hou)一種(zhong)是主(zhu)要的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)成分，即鞘(qiao)磷(lin)(lin)脂(zhi)、膽固醇、1-棕櫚酰-2-二(er)(er)(er)十二(er)(er)(er)碳六烯(xi)基-sn-甘油-3-磷(lin)(lin)酸膽堿（PC）和(he)(he)(he)血漿鹵素(su)1-（1Z-十八烯(xi)基）-2-二(er)(er)(er)十二(er)(er)(er)碳六烯(xi)基-sn-甘油-3-磷(lin)(lin)酸膽堿（P-PC）。在(zai)這(zhe)一單(dan)層(ceng)(ceng)(ceng)中(zhong)，膽固醇和(he)(he)(he)鞘(qiao)磷(lin)(lin)脂(zhi)在(zai)34°C處由(you)PC和(he)(he)(he)P-PC的(de)(de)(de)(de)液體(ti)(ti)混(hun)合(he)物(wu)包圍，形成凝(ning)聚(ju)結(jie)構(gou)(gou)域?C.LDL和(he)(he)(he)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)在(zai)接近(jin)生物(wu)膜(mo)相(xiang)(xiang)關壓力的(de)(de)(de)(de)情(qing)(qing)況下(xia)(xia)被引入單(dan)層(ceng)(ceng)(ceng)下(xia)(xia)方的(de)(de)(de)(de)亞相(xiang)(xiang)[36]。通過(guo)監測表面(mian)積的(de)(de)(de)(de)變化(hua)來(lai)檢測添加劑與(yu)(yu)單(dan)層(ceng)(ceng)(ceng)膜(mo)之間(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)互作(zuo)用(yong)(yong)。最(zui)后(hou)，在(zai)相(xiang)(xiang)同(tong)的(de)(de)(de)(de)精(jing)(jing)子膜(mo)外(wai)小(xiao)葉脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)模型和(he)(he)(he)相(xiang)(xiang)同(tong)的(de)(de)(de)(de)條件下(xia)(xia)，比(bi)較了LDL和(he)(he)(he)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)(ti)對BSP蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)的(de)(de)(de)(de)隔離(li)特性(xing)。

2、材料和方法

2.1.材料

主(zhu)要(yao)構成重構膜(mo)外小葉(xie)的脂(zhi)質購自(zi)Avanti Polar Lipides（美國阿(a)拉伯斯特市阿(a)拉伯斯特市），并按接收(shou)時使(shi)用。化合物1-棕櫚(lv)酰-2-二十(shi)(shi)二碳(tan)(tan)六烯基(ji)-sn-甘(gan)油-3-磷酸膽(dan)堿（PC（16:0/22:6），分子量=806.1，純(chun)度(du)>99%）和1-（1Z-十(shi)(shi)八烷基(ji)）-2-二十(shi)(shi)二碳(tan)(tan)六烯基(ji)-sn-甘(gan)油-3-磷酸膽(dan)堿PC（P-18:0/22:6，分子量=818.2，純(chun)度(du)>99%）作為氯(lv)仿溶(rong)液(ye)（10mg-mL）獲得(de)?1).將PC（16:0/22:6）和P-PC（18:0/22:6）的儲備溶(rong)液(ye)稀釋(shi)至1.25 mg mL?1解決方案。以(yi)綿(mian)羊毛(mao)膽(dan)固(gu)醇(chun)（Chol，Mw=711.0，純(chun)度(du)>98%）和雞蛋鞘磷脂(zhi)（SM，Mw=386.7，純(chun)度(du)>98%）為粉(fen)末。二者均以(yi)1.25 mg/mL的濃(nong)度(du)溶(rong)解于氯(lv)仿（HPLC級，法國瓦爾德魯伊爾Carlo Erba）?1.

低溫(wen)保護培養基(ji)由(you)Trizma堿（173.0 mM）、一(yi)水合(he)檸檬酸(suan)(suan)(suan)（70.0 mM）、果糖（56.0 mM）、甘油(you)（6.4%；v/v）和抗生(sheng)素（青霉素G鈉(na)391 mg L）組成(cheng)?1，硫(liu)酸(suan)(suan)(suan)鏈霉素856 mg L?1，鹽(yan)酸(suan)(suan)(suan)林可(ke)霉素204 mg L?1，硫(liu)酸(suan)(suan)(suan)大觀霉素四(si)水合(he)物585 mg L?1）（西格瑪-奧爾德(de)里奇(qi)，法國圣昆(kun)廷(ting)法拉維(wei)爾）。將(jiang)pH值(zhi)調整為6.2，其滲透壓約(yue)為1300.0 mOsm。

2.2.低密度脂蛋白的提取

根據(ju)Moussa等(deng)人的(de)方案，從(cong)蛋(dan)(dan)黃(huang)中(zhong)提取低(di)密(mi)度(du)(du)脂蛋(dan)(dan)白（LDL）[31]。提取后，將低(di)密(mi)度(du)(du)脂蛋(dan)(dan)白濃(nong)縮提取物（22±0.5 g，相當(dang)于8.36 g干(gan)低(di)密(mi)度(du)(du)脂蛋(dan)(dan)白）在(zai)低(di)溫保(bao)護介質(zhi)（100 mL）中(zhong)稀(xi)釋。通過micro BCA蛋(dan)(dan)白質(zhi)分(fen)析(xi)試劑(ji)盒（Pierce，Thermoscitific，France）對(dui)LDL樣(yang)品中(zhong)的(de)蛋(dan)(dan)白質(zhi)進行定量(liang)，得(de)出8.9±1.0 mg-mL?1.LDL樣(yang)品中(zhong)PC磷脂的(de)含量(liang)是根據(ju)雞蛋(dan)(dan)中(zhong)PC的(de)自(zi)然比例（18.4 g PC/100 g干(gan)LDL）計算得(de)出的(de)，Givenbyonton等(deng)人[33]。它等(deng)于15.4克升?1份低(di)密(mi)度(du)(du)脂蛋(dan)(dan)白樣(yang)品。LDL也含有一小部分(fen)PE（PC/PE 6:1）[33]。

2.3.精漿收集

從一頭Prim Holstein公牛身上(shang)(shang)收集牛精子，并(bing)立即以10000×g離心(xin)兩次(ci)，以回收上(shang)(shang)清液中的精漿。我們樣(yang)品的蛋(dan)白質(zhi)含(han)量為88.5±5.0mg-mL?1，由(you)micro BCA蛋(dan)白質(zhi)分析(xi)試劑盒(he)（Pierce，Thermoscitific，法國）測定。

2.4.脂質體的制備

脂(zhi)(zhi)質體由冷凍保護(hu)(hu)緩(huan)沖(chong)液中(zhong)的(de)卵磷(lin)脂(zhi)(zhi)提(ti)取物(wu)通過使用Avanti Polar Lipides（美國(guo)阿(a)(a)拉(la)(la)巴(ba)馬(ma)(ma)州(zhou)阿(a)(a)拉(la)(la)巴(ba)馬(ma)(ma)州(zhou)阿(a)(a)拉(la)(la)巴(ba)馬(ma)(ma)州(zhou)阿(a)(a)拉(la)(la)巴(ba)馬(ma)(ma)州(zhou)阿(a)(a)拉(la)(la)巴(ba)馬(ma)(ma)州(zhou)）的(de)微型(xing)擠(ji)(ji)出(chu)機(ji)(ji)擠(ji)(ji)出(chu)而制備(bei)。卵磷(lin)脂(zhi)(zhi)提(ti)取物(wu)由磷(lin)脂(zhi)(zhi)酰(xian)膽堿（73%）和(he)磷(lin)脂(zhi)(zhi)酰(xian)乙醇胺（11%）以(yi)及甘油三(san)酯(zhi)和(he)鞘磷(lin)脂(zhi)(zhi)等次(ci)要成(cheng)分組成(cheng)。提(ti)取物(wu)在低(di)溫(wen)保護(hu)(hu)緩(huan)沖(chong)液中(zhong)水合(he)過夜，脂(zhi)(zhi)質濃度分別為3.90 mg-mL?1（C1），7.28毫(hao)克(ke)/毫(hao)升(sheng)(sheng)(sheng)?1（C2），14.56毫(hao)克(ke)/毫(hao)升(sheng)(sheng)(sheng)?1（C3）和(he)21.84毫(hao)克(ke)/毫(hao)升(sheng)(sheng)(sheng)?1（C4）。然后在超(chao)(chao)聲波浴(yu)中(zhong)對分散(san)液進(jin)行15分鐘(zhong)的(de)超(chao)(chao)聲波處理（Elmasonic S 30H，來自德國(guo)Singen Elma，功率為275W）。最后，在擠(ji)(ji)出(chu)機(ji)(ji)中(zhong)擠(ji)(ji)出(chu)分散(san)體（20次(ci)穿過100 nm的(de)膜）。分布(bu)尺(chi)寸集中(zhong)在120nm，Zeta電位值為?6毫(hao)伏。在BSP存在下引入的(de)脂(zhi)(zhi)質體量以(yi)重量表示（脂(zhi)(zhi)質體分散(san)體C1、C2、C3和(he)C4分別為1.17 mg、2.18 mg、4.37 mg和(he)6.55 mg的(de)脂(zhi)(zhi)質）。不確定度為0.01 mg。

2.5.電泳

十(shi)二烷基(ji)(ji)硫酸鈉-聚(ju)丙烯酰(xian)胺凝(ning)膠電(dian)泳(yong)（SDS-PAGE）在(zai)還(huan)原條件下(xia)進(jin)(jin)行(xing)。將精(jing)(jing)漿溶解在(zai)pH值為(wei)6.8的(de)緩沖液(ye)(ye)中，該緩沖液(ye)(ye)由(you)(you)Tris 0.5 M、SDS 10%、甘油30%w/w和溴酚藍(lan)(lan)0.4%組(zu)成，以獲(huo)得(de)1mg mL?1解決方案。添加(jia)9%巰基(ji)(ji)乙醇v/v，并(bing)旋轉樣品，隨后(hou)在(zai)95℃下(xia)加(jia)熱(re)?C 5分(fen)鐘。然(ran)后(hou)，將10?L低范圍分(fen)子量標準品（法(fa)國Souffelweyersheim Euromedex公司的(de)試劑盒O6U-0511）和10至(zhi)25?L精(jing)(jing)漿裝入15%聚(ju)丙烯酰(xian)胺凝(ning)膠（pH 6.8-Tris 0.5 M和SDS 0.10%）中，并(bing)與由(you)(you)Tris 0.025 M、甘氨酸0.192 M和SDS 0.1%組(zu)成的(de)pH 8.3遷移緩沖液(ye)(ye)耦(ou)合。在(zai)20 mA時進(jin)(jin)行(xing)電(dian)泳(yong)，并(bing)用(yong)考馬斯(si)藍(lan)(lan)溶液(ye)(ye)G250對(dui)凝(ning)膠進(jin)(jin)行(xing)染色(se)。最后(hou)對(dui)染色(se)凝(ning)膠進(jin)(jin)行(xing)掃描，并(bing)使用(yong)Multi-Gauge軟件（2.0版，日(ri)本富(fu)士(shi)照片膠片有限公司）評估峰值強度。

2.6.表面活性測量

吉布斯(si)膜（由(you)精(jing)(jing)漿溶液擴散到(dao)空氣(qi)-緩(huan)沖界面(mian)(mian)形(xing)成）的(de)表面(mian)(mian)張力在安裝(zhuang)在朗繆(mou)爾天(tian)平（Microtoul XL-LB，Kibron Inc.，Helsinki，芬蘭）上的(de)15孔(kong)板（帶特氟隆邊緣的(de)鋁(lv)底多孔(kong)板）上測(ce)量(liang)，該天(tian)平配有高靈(ling)敏度(du)傳感器（使用(yong)合金絲的(de)Wilhelmy方法）。該裝(zhuang)置(zhi)被放置(zhi)在一(yi)個(ge)溫度(du)控制區，固(gu)定在23°C?C，并用(yong)純蒸餾水（美國密理(li)博(bo)公司(si)Milli-Q系(xi)統）校準。測(ce)量(liang)精(jing)(jing)度(du)為0.1 mN/m。將(jiang)精(jing)(jing)漿放入第(di)一(yi)個(ge)孔(kong)中，然后在下一(yi)個(ge)孔(kong)中用(yong)因子2稀(xi)釋(shi)，依此類(lei)推（每個(ge)孔(kong)的(de)體(ti)積為300?L）。每種(zhong)精(jing)(jing)漿提(ti)取物重復測(ce)量(liang)4次（n=2）。結果表示為所有測(ce)量(liang)的(de)平均值。

蛋白質膜的(de)壓縮(suo)等(deng)溫線是在(zai)(zai)之(zhi)前配(pei)備(bei)傳感器的(de)朗(lang)繆爾(er)(er)槽（MicroTour XL-LB，Kibron Inc.，芬蘭赫爾(er)(er)辛基）上測量的(de)。精漿首先在(zai)(zai)冷凍保存緩(huan)沖(chong)液(ye)（1/100）中稀釋，并在(zai)(zai)緩(huan)沖(chong)液(ye)表面(mian)逐滴（50?L）擴散(san)。平衡20分鐘后，在(zai)(zai)室溫下（23℃）記錄壓縮(suo)等(deng)溫線?C）。

2.7.精子膜外小葉脂質結構域的重建

精子(zi)膜(mo)外(wai)小葉的(de)(de)脂(zhi)(zhi)質結構域如前所述(shu)重建[35]。朗(lang)格繆爾槽（302LL，NIMA技(ji)術，英國）被(bei)插入一個自制(zhi)的(de)(de)手套(tao)箱上，放置在(zai)(zai)抗振動(dong)(dong)臺(tai)上，用(yong)(yong)(yong)氬(ya)氣(qi)沖(chong)洗，以避免脂(zhi)(zhi)質氧化。表面壓(ya)(ya)力(li)(li)的(de)(de)測量精度(du)為0.1 mN/m，使用(yong)(yong)(yong)濾(lv)紙制(zhi)成的(de)(de)一塊極板（英國肯特郡邁德斯通(tong)惠(hui)特曼國際(ji)有限公司生產的(de)(de)無灰惠(hui)特曼色譜紙）與(yu)電子(zi)天(tian)平(ping)相連。環(huan)境溫度(du)固(gu)定在(zai)(zai)20℃?C.將所有燒(shao)瓶和注(zhu)射(she)器(qi)(qi)放入手套(tao)箱中，然后在(zai)(zai)攤鋪單層(ceng)(ceng)之前用(yong)(yong)(yong)氬(ya)氣(qi)將手套(tao)箱脫氣(qi)1小時(shi)。朗(lang)繆爾天(tian)平(ping)的(de)(de)溫度(du)由(you)(you)設置為40℃的(de)(de)循環(huan)水(shui)系統(tong)進行恒溫控制(zhi)?C.緩(huan)沖(chong)液表面的(de)(de)實際(ji)溫度(du)為34℃?C.亞(ya)相由(you)(you)低溫保(bao)護介(jie)質組成。以適當的(de)(de)摩(mo)爾比（31:14:16:39）將膽固(gu)醇、鞘磷脂(zhi)(zhi)、P-PC（18:0/22:6）和PC（16:0/22:6）的(de)(de)氯仿溶液用(yong)(yong)(yong)25?L微型注(zhu)射(she)器(qi)(qi)（精確到0.5?L）逐(zhu)滴地(di)分(fen)散到緩(huan)沖(chong)液亞(ya)相上（Hamilton Bonaduz AG，Bonaduz，Switzterland）。單層(ceng)(ceng)保(bao)持平(ping)衡10分(fen)鐘(zhong)，然后以40 cm2/min的(de)(de)屏障速度(du)開始壓(ya)(ya)縮(suo)。一旦達到目標壓(ya)(ya)力(li)(li)（25 mN/m），通(tong)過調(diao)整可移(yi)動(dong)(dong)屏障的(de)(de)表面積(ji)保(bao)持壓(ya)(ya)力(li)(li)恒定。由(you)(you)于單分(fen)子(zi)層(ceng)(ceng)在(zai)(zai)30 mN/m時(shi)不夠穩(wen)定，這是與(yu)雙(shuang)層(ceng)(ceng)中脂(zhi)(zhi)質堆積(ji)密度(du)相關的(de)(de)膜(mo)壓(ya)(ya)力(li)(li)[36]，我們將目標壓(ya)(ya)力(li)(li)降低到25 mN/m，其中單分(fen)子(zi)層(ceng)(ceng)更穩(wen)定（見結果(guo)）。

一旦達(da)到目(mu)標壓(ya)力(li)（25 mN/m），將其保持1000 s，然后使用彎曲針管將生(sheng)(sheng)物(wu)分子(zi)(zi)（LDL、BSP或脂(zhi)質(zhi)(zhi)體(ti)）溶(rong)(rong)液引入亞(ya)(ya)(ya)相(xiang)。針頭彎曲遠離針尖，并位于槽的(de)(de)底部(bu)，以便(bian)在壓(ya)縮的(de)(de)亞(ya)(ya)(ya)相(xiang)下(xia)方進行注射。之前(qian)將當量體(ti)積(ji)（每種(zhong)添加劑0.3 mL）移到屏(ping)障后面(mian)。注射生(sheng)(sheng)物(wu)分子(zi)(zi)后，監(jian)測每個脂(zhi)質(zhi)(zhi)分子(zi)(zi)的(de)(de)面(mian)積(ji)變化，并表(biao)示(shi)為相(xiang)對(dui)于初始值的(de)(de)變化（a/a=（a?A（t0）×100/A（t0）。它已經被跟蹤了3000秒，相(xiang)當于冷凍(dong)保存前(qian)處理精液的(de)(de)時間。在這(zhe)種(zhong)恒壓(ya)模(mo)式下(xia)，生(sheng)(sheng)物(wu)分子(zi)(zi)插入脂(zhi)質(zhi)(zhi)單層導(dao)致膜壓(ya)力(li)增加，而膜壓(ya)力(li)通過增加表(biao)面(mian)積(ji)而降低。相(xiang)反，如果生(sheng)(sheng)物(wu)分子(zi)(zi)導(dao)致脂(zhi)質(zhi)(zhi)單層溶(rong)(rong)解在亞(ya)(ya)(ya)相(xiang)中，表(biao)面(mian)積(ji)就會減小。重(zhong)復所有(you)數據，偏(pian)差不超過表(biao)面(mian)積(ji)的(de)(de)5%。

2.8.低溫透射電子顯微鏡（Cryo TEM）

使(shi)用(yong)低溫(wen)(wen)插入式低溫(wen)(wen)固定(ding)裝置（美(mei)國(guo)加(jia)坦）制(zhi)備用(yong)于低溫(wen)(wen)TEM觀察的(de)試樣，其中一滴水懸浮液(ye)(ye)(ye)(ye)沉積在(zai)(zai)輝光(guang)放(fang)電(dian)多孔(kong)型碳涂層格柵（美(mei)國(guo)Ted Pella公司）上。然后(hou)，通過將含有試樣的(de)液(ye)(ye)(ye)(ye)滴吸干(gan)到支撐碳膜(mo)孔(kong)上殘留的(de)薄層液(ye)(ye)(ye)(ye)體上，制(zhi)備TEM網(wang)格。通過將格柵快速插入液(ye)(ye)(ye)(ye)氮冷(leng)(leng)卻的(de)液(ye)(ye)(ye)(ye)態乙烷中，使(shi)液(ye)(ye)(ye)(ye)膜(mo)玻(bo)璃化。玻(bo)璃化標本安裝在(zai)(zai)Gatan 910標本架(jia)（美(mei)國(guo)Gatan）中，使(shi)用(yong)CT-3500-cryotransfer系統（美(mei)國(guo)Gatan）將其插入顯微(wei)鏡中，并用(yong)液(ye)(ye)(ye)(ye)氮冷(leng)(leng)卻。然后(hou)從保存在(zai)(zai)玻(bo)璃質(zhi)冰(bing)中并懸浮在(zai)(zai)支撐碳基質(zhi)上的(de)孔(kong)中的(de)標本獲(huo)得TEM圖像。

在(zai)低劑量條件下觀察樣品（<10 e?/A2），在(zai)?178?C、使用JEM 1230“Cryo”顯(xian)微鏡（日本Jeol），在(zai)80 kV電壓下運(yun)行，并配備LaB6燈絲。所有顯(xian)微照(zhao)片(pian)均(jun)記(ji)錄在(zai)Gatan 1.35K×1.04K×12位ES500W CCD相機上。為(wei)確(que)保觀察的良好(hao)重復性，從幾個樣品制備中采集了一系列超過50張的圖像，放(fang)大率不同。