摘要

顳葉(xie)素是最早從歐洲紅蛙（Rana temporaria）的(de)(de)(de)皮膚中分離出的(de)(de)(de)短（10-13個氨基(ji)酸）線性抗(kang)菌(jun)(jun)肽，對革蘭氏陽性細(xi)(xi)菌(jun)(jun)和(he)(he)白(bai)色念珠菌(jun)(jun)有效。為了(le)(le)(le)深入了(le)(le)(le)解其作(zuo)用(yong)機制，我(wo)們(men)比較了(le)(le)(le)該家族的(de)(de)(de)兩個成員(yuan)對模型膜(mo)的(de)(de)(de)影響，即。，temporin B（LLPIVGNLLKSLL-NH2）和(he)(he)temporin L（FVQWFSKFLGRIL-NH2）。更具(ju)體(ti)地說，我(wo)們(men)測量了(le)(le)(le)它(ta)們(men)插入脂(zhi)質單分子膜(mo)以及(ji)它(ta)們(men)對脂(zhi)質體(ti)雙(shuang)層(ceng)結(jie)構動力學(xue)的(de)(de)(de)影響，如(ru)二苯基(ji)己三烯（DPH）和(he)(he)芘標記的(de)(de)(de)磷(lin)(lin)脂(zhi)所揭示(shi)的(de)(de)(de)。我(wo)們(men)還觀察了(le)(le)(le)這(zhe)(zhe)些肽對巨(ju)(ju)大(da)囊泡拓撲結(jie)構的(de)(de)(de)影響。這(zhe)(zhe)兩種時(shi)間蛋白(bai)都很(hen)容易滲透(tou)到脂(zhi)質單層(ceng)中，在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)常見細(xi)(xi)菌(jun)(jun)帶(dai)負電的(de)(de)(de)磷(lin)(lin)脂(zhi)-磷(lin)(lin)脂(zhi)酰(xian)(xian)(xian)甘油(you)(you)(you)的(de)(de)(de)存(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)下(xia)，它(ta)們(men)的(de)(de)(de)嵌入作(zuo)用(yong)增強。相(xiang)反，真核細(xi)(xi)胞(bao)脂(zhi)質膽固(gu)醇確實(shi)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)一定程度上抵消了(le)(le)(le)它(ta)們(men)滲透(tou)到脂(zhi)質膜(mo)中的(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)。temporin B和(he)(he)temporin L均導(dao)致磷(lin)(lin)脂(zhi)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)雙(shuang)層(ceng)中富集，并且在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)1-棕櫚酰(xian)(xian)(xian)-2-油(you)(you)(you)酰(xian)(xian)(xian)基(ji)-sn-甘油(you)(you)(you)-3-磷(lin)(lin)酸甘油(you)(you)(you)（POPG）存(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)下(xia)，這(zhe)(zhe)些肽增加了(le)(le)(le)酰(xian)(xian)(xian)基(ji)鏈順序。Temporin B實(shi)際上對由1-硬脂(zhi)酰(xian)(xian)(xian)-2-油(you)(you)(you)酰(xian)(xian)(xian)基(ji)-sn-甘油(you)(you)(you)-3-磷(lin)(lin)酸膽堿（SOPC）組成的(de)(de)(de)巨(ju)(ju)大(da)脂(zhi)質體(ti)沒有影響，而當存(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)POPG時(shi)觀察到快速發泡。相(xiang)反，temporin L誘導(dao)SOPC和(he)(he)SOPC/POPG巨(ju)(ju)囊泡形(xing)成，而SOPC巨(ju)(ju)囊泡中膽固(gu)醇的(de)(de)(de)存(cun)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)減弱了(le)(le)(le)這(zhe)(zhe)種作(zuo)用(yong)。

抗(kang)菌(jun)肽(tai)廣(guang)泛分布于自然界，是(shi)(shi)無脊椎動(dong)物(wu)(wu)和(he)脊椎動(dong)物(wu)(wu)天(tian)然免疫(yi)的(de)(de)重(zhong)要組成部分，可防止多種有害微生(sheng)物(wu)(wu)的(de)(de)入侵和(he)增殖。尤其(qi)是(shi)(shi)無尾類動(dong)物(wu)(wu)（青(qing)蛙(wa)(wa)(wa)和(he)蟾蜍）的(de)(de)皮膚(fu)是(shi)(shi)抗(kang)菌(jun)肽(tai)的(de)(de)豐富來(lai)源，其(qi)結(jie)構(gou)和(he)活性(xing)譜都具有很大(da)的(de)(de)多樣性(xing)（1，2）。通常大(da)量生(sheng)產，幾(ji)種具有不(bu)同抗(kang)菌(jun)特(te)性(xing)的(de)(de)不(bu)同肽(tai)通常存(cun)在于單(dan)個(ge)動(dong)物(wu)(wu)的(de)(de)皮膚(fu)提取物(wu)(wu)中。這種多樣性(xing)被認為(wei)對保護(hu)青(qing)蛙(wa)(wa)(wa)免受更(geng)廣(guang)泛的(de)(de)有害入侵者的(de)(de)侵害很重(zhong)要（3）。蛙(wa)(wa)(wa)皮抗(kang)菌(jun)肽(tai)是(shi)(shi)在稱為(wei)顆粒腺的(de)(de)特(te)殊皮膚(fu)結(jie)構(gou)中產生(sheng)和(he)儲存(cun)的(de)(de)，在腎上腺素能刺激或皮膚(fu)損傷時釋放其(qi)內容物(wu)(wu)。一大(da)類不(bu)斷擴大(da)的(de)(de)蛙(wa)(wa)(wa)抗(kang)菌(jun)肽(tai)，統稱為(wei)前表皮抑制素，已被證明(ming)具有高度保守的(de)(de)N端前序列(lie)和(he)具有與抗(kang)菌(jun)肽(tai)對應(ying)的(de)(de)可變序列(lie)的(de)(de)C端結(jie)構(gou)域（4）。

目(mu)前，對(dui)蛙皮(pi)和其他來源的(de)(de)抗(kang)(kang)菌肽(tai)(tai)進(jin)行了深入研究，以(yi)闡明其作(zuo)(zuo)用機制。作(zuo)(zuo)為這項工作(zuo)(zuo)的(de)(de)結果，抗(kang)(kang)菌肽(tai)(tai)通常被認為通過滲透(tou)或破(po)壞細(xi)(xi)胞(bao)(bao)膜(mo)的(de)(de)穩定性來殺(sha)死(si)靶細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，無論是(shi)原(yuan)核細(xi)(xi)胞(bao)(bao)還是(shi)真核細(xi)(xi)胞(bao)(bao)。然而，精確的(de)(de)機制仍不完全清(qing)楚(chu)。關于抗(kang)(kang)菌肽(tai)(tai)與生物膜(mo)和模(mo)型(xing)膜(mo)的(de)(de)相互作(zuo)(zuo)用，最近有許多優秀的(de)(de)綜述，提供了迄(qi)今為止(zhi)提出(chu)的(de)(de)用于解釋(shi)肽(tai)(tai)誘導的(de)(de)膜(mo)滲透(tou)過程的(de)(de)不同(tong)模(mo)型(xing)的(de)(de)完整視圖（5-8）。

顳(nie)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)是一類抗菌肽(tai)(tai)，首先從歐洲紅(hong)蛙的(de)(de)(de)皮膚(fu)中(zhong)分離出來（9）。最近，在(zai)林蛙屬其他物種(zhong)的(de)(de)(de)皮膚(fu)提取(qu)物中(zhong)發(fa)現了顳(nie)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)家(jia)族(zu)(zu)的(de)(de)(de)新成(cheng)員，即(ji)。，R、clamitans（10）、luteiVentris（11）、pipiens（11）和grylio（12）。因此，這些(xie)發(fa)現也(ye)可以深入了解這些(xie)肽(tai)(tai)在(zai)相關物種(zhong)之間的(de)(de)(de)進化和分化（10，11）。顳(nie)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)是具有凈(jing)正電荷和酰(xian)胺化C端(duan)的(de)(de)(de)線(xian)性10-13殘(can)基(ji)長肽(tai)(tai)，在(zai)非極性溶劑（如三(san)氟乙醇）中(zhong)可能呈現兩親R螺旋構象（9，13）。發(fa)現時間蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)A和B對(dui)大腸桿菌細胞壁缺陷突變株也(ye)有活性，并釋(shi)放脂質體包埋的(de)(de)(de)熒(ying)光探針(zhen)（9，13）。該家(jia)族(zu)(zu)的(de)(de)(de)一個(ge)成(cheng)員，時間蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)D，對(dui)紅(hong)細胞有溶解作用（13）。最近對(dui)兩種(zhong)不同的(de)(de)(de)顳(nie)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)B對(dui)映體在(zai)糞便環境(jing)中(zhong)的(de)(de)(de)穩定性進行的(de)(de)(de)研究(jiu)表(biao)明，肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)D異構體的(de)(de)(de)失活速度比L異構體慢（14）。因此，當考慮治療用途時，D異構體可能更可取(qu)。

顳蛋(dan)(dan)白與脂(zhi)質的(de)相互作用(yong)尚未得到詳細研究(jiu)。為了(le)(le)更深入地了(le)(le)解這些(xie)肽的(de)作用(yong)模式，并將其(qi)與我(wo)們實(shi)驗室先(xian)前(qian)研究(jiu)過的(de)其(qi)他(ta)兩(liang)種抗菌肽（15）馬蓋寧2和(he)吲哚肽進(jin)行比較(jiao)，我(wo)們研究(jiu)了(le)(le)顳蛋(dan)(dan)白B（LLPIVGNLLKSLL-NH2）和(he)顳蛋(dan)(dan)白L（FVQWFSKFLGRIL-NH2）與模型膜的(de)相互作用(yong)。更具體(ti)地說，我(wo)們研究(jiu)了(le)(le)它(ta)們插入脂(zhi)質單層的(de)能力(li)，使用(yong)二(er)苯基(ji)己三烯（DPH）1和(he)芘標記的(de)磷脂(zhi)對(dui)脂(zhi)質雙層結構動力(li)學(xue)的(de)影(ying)響，以(yi)及對(dui)巨大脂(zhi)質體(ti)形態的(de)影(ying)響。

材料和方法

材料。Hepes和(he)(he)EDTA來(lai)(lai)自(zi)Sigma。1-硬脂(zhi)酰(xian)-2-油(you)酰(xian)基(ji)(ji)-sn-甘(gan)油(you)-3-磷(lin)(lin)酸(suan)膽(dan)(dan)堿（SOPC）、1-棕櫚(lv)酰(xian)-2-油(you)酰(xian)基(ji)(ji)-sn-甘(gan)油(you)-3-磷(lin)(lin)酸(suan)甘(gan)油(you)（POPG）和(he)(he)–膽(dan)(dan)固醇來(lai)(lai)自(zi)Avanti極性脂(zhi)質(zhi)（Alabaster，AL）。熒光磷(lin)(lin)脂(zhi)類似物1-棕櫚(lv)酰(xian)-2-[10-（芘(bi)-1-基(ji)(ji)）癸酰(xian)基(ji)(ji)]-sn-甘(gan)油(you)-3-磷(lin)(lin)酸(suan)膽(dan)(dan)堿（PPDPC）來(lai)(lai)自(zi)K&V Bioware（芬(fen)蘭埃斯波）和(he)(he)EGA Chemie（德(de)國斯坦海姆）的二(er)苯(ben)基(ji)(ji)己三(san)烯(xi)（DPH）。使用高精度(du)電子(zi)天(tian)平（Cahn、Cerritos、CA）通(tong)(tong)過重(zhong)量(liang)法(fa)測(ce)定未標記脂(zhi)質(zhi)的濃度(du)，并(bing)通(tong)(tong)過341 nm處的吸光度(du)，分別使用38000和(he)(he)88000 cm-1的摩爾消光系數(shu)測(ce)定含芘(bi)磷(lin)(lin)脂(zhi)和(he)(he)DPH的濃度(du)。在用氯仿(fang)/甲醇/水（65:25:4，v/v/v）開發的硅酸(suan)涂層板（德(de)國達姆施塔特默克公司）上，通(tong)(tong)過薄層色譜法(fa)檢(jian)查(cha)脂(zhi)質(zhi)的純度(du)。碘(dian)染色后以及在適當(dang)情況下，紫外線照(zhao)射后對平板進(jin)行(xing)檢(jian)查(cha)，未發現任何雜質(zhi)。合成(cheng)顳(nie)(nie)葉(xie)素從塔納實驗(yan)室（德(de)克薩斯州休斯頓）購買(mai)。通(tong)(tong)過HPLC分析(xi)肽的純度(du)（顳(nie)(nie)蛋(dan)白B和(he)(he)顳(nie)(nie)蛋(dan)白L的純度(du)分別大(da)于90%和(he)(he)大(da)于94%），并(bing)通(tong)(tong)過自(zi)動Edman降解(jie)和(he)(he)質(zhi)譜驗(yan)證其序列。通(tong)(tong)過重(zhong)量(liang)法(fa)和(he)(he)定量(liang)離子(zi)交換柱色譜法(fa)以及茚(yin)三(san)酮衍生法(fa)測(ce)定肽濃度(du)。

肽(tai)對(dui)脂(zhi)(zhi)質單(dan)層(ceng)的(de)滲透。使用(yong)磁力(li)攪拌的(de)圓形聚四氟乙烯孔(kong)（多孔(kong)板(ban)，亞相(xiang)體積1.2 mL，Kibron Inc.，芬蘭赫(he)爾辛基）測(ce)量(liang)(liang)肽(tai)插入(ru)位于空氣(qi)(qi)/水界面(mian)上的(de)脂(zhi)(zhi)質單(dan)層(ceng)。表(biao)面(mian)壓(ya)力(li)（π）通(tong)過連接到連接到奔騰PC的(de)微量(liang)(liang)天平（DeltaPi，Kibron Inc.）上的(de)Wilhelmy線進行監測(ce)。所(suo)示脂(zhi)(zhi)質以氯(lv)仿(fang)（約1 mg/mL）的(de)形式(shi)擴散到空氣(qi)(qi)/緩沖(chong)液（5 mM Hepes，0.1 mM EDTA，pH 7.0）界面(mian)上。隨后，在(zai)將temporins（0.3μM最終濃(nong)度(du)）注(zhu)入(ru)亞相(xiang)之(zhi)前，允許脂(zhi)(zhi)質單(dan)層(ceng)在(zai)不(bu)同初始表(biao)面(mian)壓(ya)力(li)（π0）下(xia)沉淀(dian)約15分鐘(zhong)。注(zhu)射(she)肽(tai)后π的(de)增量(liang)(liang)在(zai)大約30分鐘(zhong)內完成，初始表(biao)面(mian)壓(ya)力(li)（π0）與(yu)(yu)肽(tai)滲透到膜中后觀察到的(de)值(zhi)之(zhi)間的(de)差值(zhi)取為(wei)(wei)?π.數據(ju)表(biao)示為(wei)(wei)?πvsπ0。這些(xie)圖還得出了與(yu)(yu)阻止肽(tai)插入(ru)膜中的(de)脂(zhi)(zhi)質側向堆積密(mi)度(du)相(xiang)對(dui)應的(de)臨界表(biao)面(mian)壓(ya)力(li)πc。所(suo)有測(ce)量(liang)(liang)均在(zai)環境(jing)溫(wen)度(du)下(xia)進行，一式(shi)三份(≈+24°C）。

制備(bei)大(da)的(de)單(dan)層囊(nang)泡(pao)（LUV）。將(jiang)適量的(de)脂(zhi)質(zhi)儲備(bei)溶液(ye)混合(he)在(zai)氯仿中(zhong)以獲得(de)所(suo)需的(de)組合(he)物，其(qi)中(zhong)PPDPC（X）0.01）或DPH（X）0.002）包括作為熒光(guang)探針。在(zai)氮氣流下去除(chu)溶劑，隨后在(zai)減壓下將(jiang)脂(zhi)質(zhi)殘留物保持至少2小時(shi)。然(ran)后在(zai)50°C下將(jiang)干脂(zhi)質(zhi)在(zai)5 mM Hepes、0.1 mM EDTA、pH 7.0中(zhong)水(shui)合(he)，以產生1 mM的(de)脂(zhi)質(zhi)濃度。使用Liposofast低(di)壓均質(zhi)器（加拿大(da)渥太華Avestin）通過兩個聚碳酸酯過濾器（孔徑100 nm，Bedford，MA）堆疊擠(ji)出所(suo)得(de)分散體，以獲得(de)平均直徑在(zai)111和117 nm之(zhi)間的(de)大(da)單(dan)層囊(nang)泡(pao)（17）。

Ie/Im的(de)(de)(de)測量(liang)(liang)(liang)(liang)(liang)。芘的(de)(de)(de)輻照≈344 nm產生單體激(ji)發(fa)(fa)態(tai)，該激(ji)發(fa)(fa)態(tai)通(tong)過(guo)發(fa)(fa)射最大值為的(de)(de)(de)光(guang)子(zi)松弛回到(dao)基態(tai)≈398 nm（Im），精確的(de)(de)(de)峰能量(liang)(liang)(liang)(liang)(liang)和(he)光(guang)譜結(jie)構(gou)取(qu)決(jue)于溶(rong)劑(ji)極性。如果芘的(de)(de)(de)局(ju)部濃度(du)足夠高，激(ji)發(fa)(fa)單體可能與基態(tai)芘碰撞(zhuang)，形成激(ji)發(fa)(fa)二(er)聚體（準分(fen)(fen)(fen)子(zi)）。準分(fen)(fen)(fen)子(zi)通(tong)過(guo)發(fa)(fa)射以中(zhong)心為中(zhong)心的(de)(de)(de)寬而無(wu)特征的(de)(de)(de)量(liang)(liang)(liang)(liang)(liang)子(zi)帶，解離回兩個基態(tai)芘≈480納米（18，19）。用(yong)Perkin Elmer LS50B熒光(guang)光(guang)譜儀和(he)磁力攪拌恒(heng)溫(wen)反應杯室測量(liang)(liang)(liang)(liang)(liang)用(yong)PPDPC（X）0.01）標記(ji)的(de)(de)(de)LUV的(de)(de)(de)熒光(guang)發(fa)(fa)射光(guang)譜。激(ji)發(fa)(fa)和(he)發(fa)(fa)射均使(shi)用(yong)4 nm的(de)(de)(de)帶寬。使(shi)用(yong)的(de)(de)(de)脂質濃度(du)為20μM，溫(wen)度(du)保持在25°C。添加適(shi)量(liang)(liang)(liang)(liang)(liang)肽后，在記(ji)錄光(guang)譜之前(qian)，樣品平衡(heng)5分(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)。取(qu)三次掃描的(de)(de)(de)平均值，并分(fen)(fen)(fen)別測量(liang)(liang)(liang)(liang)(liang)Im和(he)Ie處的(de)(de)(de)發(fa)(fa)射強(qiang)度(du)。≈取(qu)398和(he)480 nm進行

DPH的(de)熒(ying)光各向異性（r）。DPH在X）0.002處包含(han)在脂質體中。使用(yong)的(de)脂質濃(nong)度為20μM，溫度保持在25°C。使用(yong)帶有Perkin Elmer LS50B的(de)寶麗來膜式(shi)(shi)過濾器以L格(ge)式(shi)(shi)測量極(ji)化發(fa)射。使用(yong)10 nm帶寬，在360 nm激發(fa)和450 nm發(fa)射下測量DPH的(de)熒(ying)光各向異性r，并(bing)使用(yong)Perkin Elmer提(ti)供的(de)軟件例程(cheng)計算(suan)其值(zhi)。

形成巨(ju)大(da)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)。如其他地方所述(shu)（20-22）制備了巨(ju)大(da)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)。將(jiang)溶解在(zai)二乙醚(mi)/甲(jia)醇（9:1，v/v，濃度為1 mM）中的(de)約1-3μL指示脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)攤鋪在(zai)兩個鉑電(dian)(dian)極(ji)的(de)表面上，然后在(zai)氮氣流下干(gan)燥(zao)。通過(guo)在(zai)真空中抽空1小時來(lai)去除可能的(de)有(you)機溶劑殘(can)留。在(zai)蔡司IM-35倒(dao)置(zhi)熒(ying)光(guang)顯微(wei)鏡的(de)工(gong)作(zuo)臺上放(fang)置(zhi)一(yi)個帶有(you)連接電(dian)(dian)極(ji)和石英窗口底(di)部的(de)玻璃(li)室(shi)。在(zai)添加1.3 mL pH值為7.4的(de)0.5 mM Hepes緩沖(chong)液之前(qian)，施加交流電(dian)(dian)場（頻(pin)率為4 Hz、振幅(fu)為0.2 V的(de)正弦波(bo)函數）。在(zai)水合作(zuo)用(yong)的(de)第(di)一(yi)分鐘內，電(dian)(dian)壓增加到1.0 V。2小時后關(guan)閉交流電(dian)(dian)場，使用(yong)霍夫曼(man)調制對比度（HMC）光(guang)學系統(tong)觀察(cha)到巨(ju)大(da)的(de)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)，其物鏡為10×/0.25（modulation optics Inc.，紐約）。巨(ju)大(da)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)的(de)大(da)小是(shi)通過(guo)微(wei)管的(de)運(yun)動校準圖像(xiang)，將(jiang)其作(zuo)為微(wei)操作(zuo)器步長（50 nm）的(de)適當(dang)倍數（帶有(you)MC2000控(kong)制器的(de)MX831、SD儀器、Grants Pass或(huo)）。使用(yong)珀(po)爾(er)貼冷卻的(de)12位數字(zi)CCD攝(she)像(xiang)機（C4742-95，日本濱松(song)）與計算機連接，并通過(guo)攝(she)像(xiang)機制造商提供的(de)軟件（HiPic 5.0.1）進(jin)行操作(zuo)，記錄圖像(xiang)。

微量(liang)注(zhu)(zhu)射(she)技術。內部(bu)尖端(duan)二聚體>0.5μm（23）的(de)(de)微移液管由硼硅酸鹽毛(mao)細管（外徑1.2 mm）通過微處理器控制的(de)(de)水平拉(la)拔器（P-87，Sutter Instrument Co.，Novato，CA）制成。將指示量(liang)的(de)(de)肽(tai)溶(rong)液（10 mM Hepes中(zhong)的(de)(de)0.5 mM，0.1 mM EDTA，pH 7.0）施(shi)加到(dao)單(dan)個巨大(da)脂(zhi)質體的(de)(de)外表面，作(zuo)為一系列約20 fL的(de)(de)單(dan)次注(zhu)(zhu)射(she)，用氣(qi)動微注(zhu)(zhu)射(she)器（PLI-100，Medical Systems Corp.，Greenvale，NY）輸送。為了便于操(cao)作(zuo)，只(zhi)使(shi)用附(fu)著在電極表面的(de)(de)囊泡(pao)。所有(you)實驗均在環境溫度下進行(≈+并重復至少10次。

結果

顳葉素對(dui)(dui)脂(zhi)(zhi)(zhi)質單(dan)層的(de)(de)(de)(de)滲(shen)透。在將(jiang)配體(ti)（如肽(tai)）注射到水/氣(qi)界(jie)面(mian)(mian)上的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質單(dan)分(fen)子膜中后(hou)(hou)，將(jiang)其插(cha)入到水/氣(qi)界(jie)面(mian)(mian)上的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質單(dan)分(fen)子膜中會導致增(zeng)(zeng)加(jia)?π、在表(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)(ya)力(li)下。獲(huo)得的(de)(de)(de)(de)數據表(biao)示為(wei)?π、作(zuo)為(wei)薄膜初始表(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)(ya)力(li)的(de)(de)(de)(de)函數，π0（15，16）。表(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)(ya)力(li)變化的(de)(de)(de)(de)幅度(du)可(ke)用(yong)于評估(gu)肽(tai)-脂(zhi)(zhi)(zhi)質相互(hu)作(zuo)用(yong)的(de)(de)(de)(de)相對(dui)(dui)能(neng)量，并(bing)表(biao)征肽(tai)的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質特異性（綜述見16）。先前采用(yong)該(gai)技術(shu)的(de)(de)(de)(de)研(yan)究表(biao)明，抗(kang)菌肽(tai)，如馬蓋寧2和(he)吲(yin)哚肽(tai)，可(ke)以有(you)效插(cha)入脂(zhi)(zhi)(zhi)質膜（15）。同(tong)樣(yang)，顳蛋(dan)白B和(he)顳蛋(dan)白L均有(you)效插(cha)入脂(zhi)(zhi)(zhi)質單(dan)層，如初始壓(ya)(ya)(ya)力(li)（π0）為(wei)0.20）時的(de)(de)(de)(de)SOPC/POPG膜（XPOPG）所示≈15 mN/m（圖1）。然(ran)而，兩種肽(tai)表(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)(ya)力(li)增(zeng)(zeng)加(jia)的(de)(de)(de)(de)動(dong)(dong)力(li)學明顯不(bu)同(tong)。因此，在亞(ya)相中加(jia)入顳蛋(dan)白B（圖1，圖A）后(hou)(hou)，π出(chu)現快(kuai)速瞬態峰值，然(ran)后(hou)(hou)是松弛，然(ran)后(hou)(hou)是π緩慢增(zeng)(zeng)加(jia)。這些動(dong)(dong)力(li)學與脂(zhi)(zhi)(zhi)質成分(fen)無關，初始表(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)(ya)力(li)在12-36 mN/m范圍(wei)內變化。相反，對(dui)(dui)于Temporan L，表(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)(ya)力(li)值以連續(xu)方式增(zeng)(zeng)加(jia)，在大(da)約40分(fen)鐘內達到平臺（圖1，面(mian)(mian)板B）。現階(jie)段未對(dui)(dui)動(dong)(dong)力(li)學進(jin)行更詳(xiang)細(xi)的(de)(de)(de)(de)研(yan)究。

隨(sui)后從以下(xia)(xia)方面分(fen)(fen)析(xi)了來自上述類似(si)測量的數據：?πvsπ0（圖(tu)1，面板(ban)(ban)C和D）。時(shi)間蛋(dan)白(bai)B很容易(yi)插入到(dao)高(gao)達(da)π0的SOPC單(dan)分(fen)(fen)子膜(mo)中(zhong)(zhong)≈39 mN/m，其中(zhong)(zhong)?π-π0數據點外推到(dao)?π)0.因此，該值(zhi)表(biao)(biao)示該肽(tai)不再插入SOPC單(dan)層(ceng)(ceng)的臨界包(bao)(bao)裝壓(ya)力πc（圖(tu)1，面板(ban)(ban)c）。與(yu)其凈(jing)正電荷+2一(yi)致，當膜(mo)中(zhong)(zhong)酸(suan)性磷(lin)脂POPG的含量增(zeng)加(jia)(jia)時(shi)，時(shi)間蛋(dan)白(bai)B向(xiang)脂質單(dan)層(ceng)(ceng)的滲(shen)透逐漸增(zeng)強（圖(tu)1，面板(ban)(ban)C），πC的值(zhi)急劇增(zeng)加(jia)(jia)。有(you)趣的是，當XPOPG在0.10和0.40之間變化(hua)時(shi)?temporin B的πvsπ0數據在表(biao)(biao)面壓(ya)力為的情況下(xia)(xia)顯示出(chu)一(yi)個“交叉”點≈32 mN/m。具(ju)體(ti)來說，在后一(yi)個表(biao)(biao)面壓(ya)力以下(xia)(xia)，增(zeng)加(jia)(jia)?π隨(sui)著(zhu)膜(mo)中(zhong)(zhong)POPG的增(zeng)加(jia)(jia)而(er)增(zeng)加(jia)(jia)，而(er)在π0>32mn/m時(shi)觀察到(dao)相反的情況。πc的值(zhi)在序列中(zhong)(zhong)降低≈64,≈55，和≈當XPOPG分(fen)(fen)別從0.10增(zeng)加(jia)(jia)到(dao)0.20和0.40時(shi)，為48 mN/m（圖(tu)1，面板(ban)(ban)E）。將膽固醇（X）0.10）包(bao)(bao)含在SOPC膜(mo)中(zhong)(zhong)抑制(zhi)了該肽(tai)在π0處插入單(dan)層(ceng)(ceng)≈27 mN/m（圖(tu)1，面板(ban)(ban)C），而(er)πC增(zeng)加(jia)(jia)到(dao)≈4200萬/米。

圖1：將(jiang)時間蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)B和(he)L插入(ru)脂(zhi)質(zhi)單層。在初始表(biao)(biao)面壓(ya)(ya)力(li)（π0）分(fen)別(bie)(bie)為(wei)(wei)14.6和(he)15.5 mN/m的(de)(de)情況下，在SOPC/POPG（XPOPG）0.2）單層下方注(zhu)射(she)顳蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)B（面板a）或顳蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)L（面板B）后，表(biao)(biao)面壓(ya)(ya)力(li)隨(sui)時間的(de)(de)增(zeng)(zeng)加(jia)而增(zeng)(zeng)加(jia)。肽（0.3μM最終濃度）的(de)(de)添(tian)加(jia)用箭頭標記。表(biao)(biao)面壓(ya)(ya)力(li)增(zeng)(zeng)量(?π）將(jiang)0.3μM顳蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)B（圖C）或顳蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)L（圖D）添(tian)加(jia)到亞(ya)相中導致的(de)(de)脂(zhi)質(zhi)單分(fen)子膜(mo)的(de)(de)數量表(biao)(biao)示為(wei)(wei)初始表(biao)(biao)面壓(ya)(ya)力(li)（π0）的(de)(de)函數。SOPC中POPG（XPOPG）的(de)(de)含量分(fen)別(bie)(bie)為(wei)(wei)0（0）、0.10（9）、0.20（b）和(he)0.40（2）。還顯示了(le)將(jiang)肽插入(ru)具有Xchol）0.1（3）的(de)(de)SOPC膜(mo)中。圖E顯示了(le)πc的(de)(de)值(zhi)(zhi)，分(fen)別(bie)(bie)作為(wei)(wei)滲透時間蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)B（O）和(he)時間蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)L（B）時XPOPG的(de)(de)函數。每個數據點代表(biao)(biao)三次測量的(de)(de)平均(jun)值(zhi)(zhi)。標準偏差在0.1和(he)0.8 mN/m之間變化(hua)，為(wei)(wei)清晰(xi)起(qi)見，未顯示。

也(ye)觀(guan)察到由于(yu)顳(nie)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)L，π顯著增(zeng)(zeng)加，表(biao)明(ming)其(qi)滲透(tou)到SOPC單層（圖(tu)1，面(mian)(mian)板D）。然(ran)而，temporin L明(ming)顯比temporin B更具(ju)(ju)膜活性，具(ju)(ju)有(you)πc≈54 mN/m。與temporin B類似，單分(fen)子層中POPG含量的(de)(de)(de)增(zeng)(zeng)加增(zeng)(zeng)強(qiang)了temporin L的(de)(de)(de)滲透(tou)性，增(zeng)(zeng)加了?π以下≈43 mN/m（圖(tu)1，面(mian)(mian)板D）。然(ran)而，在表(biao)面(mian)(mian)壓力的(de)(de)(de)后一(yi)個“交叉(cha)”值(zhi)以上，由于(yu)時(shi)間(jian)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)L引起的(de)(de)(de)π增(zeng)(zeng)量被(bei)POPG略微衰(shuai)減，導致在存在POPG的(de)(de)(de)情(qing)況(kuang)下πc減小，轉移(yi)到≈53,≈51，和≈XPOPG時(shi)為50 mN/m），分(fen)別為0.10、0.20和0.40（圖(tu)1，面(mian)(mian)板E）。至(zhi)于(yu)顳(nie)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)B，由顳(nie)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)L引起的(de)(de)(de)π增(zeng)(zeng)量被(bei)膽固醇（Xchol）0.10減弱，而πc從≈54至(zhi)≈48 mN/m（圖(tu)1，面(mian)(mian)板D）。

顳(nie)蛋白對(dui)(dui)雙層脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)動(dong)力學(xue)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)影(ying)響。隨(sui)后通過記錄摻入LUVs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)芘標(biao)記熒光(guang)(guang)磷(lin)脂(zhi)類(lei)似物PPDPC（X）0.01）的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)發(fa)射光(guang)(guang)譜來研(yan)(yan)究肽(tai)(tai)與(yu)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)體(ti)結合(he)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)后果(guo)。對(dui)(dui)于(yu)(yu)含有脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)類(lei)似物（如(ru)PPDPC）的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)單個(ge)芘部(bu)分(fen)，穩態Ie/Im值反映了(le)膜中熒光(guang)(guang)團的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)橫向遷移率和(he)局(ju)部(bu)濃度(du)（18，19）。然而(er)(er)，我們之前的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)(yan)究比(bi)較(jiao)了(le)兩種(zhong)其他抗(kang)菌肽(tai)(tai)（馬蓋寧(ning)2和(he)吲哚肽(tai)(tai)）對(dui)(dui)膜脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)動(dong)力學(xue)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)影(ying)響，發(fa)現這(zhe)(zhe)些(xie)肽(tai)(tai)也影(ying)響芘標(biao)記脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)量(liang)子(zi)產率（15）。對(dui)(dui)于(yu)(yu)SOPC LUV，添加(jia)temporin B分(fen)別導致芘單體(ti)和(he)準分(fen)子(zi)發(fa)射Im和(he)Ie的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)顯(xian)著(zhu)減(jian)(jian)少(shao)(shao)，最(zui)大減(jian)(jian)少(shao)(shao)約(yue)40%（圖2，面(mian)(mian)板(ban)(ban)a和(he)B）。芘熒光(guang)(guang)帶的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)猝(cu)滅是雙相的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，當(dang)(dang)時(shi)間(jian)蛋白B與(yu)脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)摩(mo)爾比(bi)約(yue)為1:12時(shi)，量(liang)子(zi)產率顯(xian)著(zhu)降低(di)（圖2，面(mian)(mian)板(ban)(ban)a和(he)B）。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)膽固醇(chun)（Xchol）0.10）存在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)情(qing)況下(xia)，temporin B對(dui)(dui)芘單體(ti)和(he)準分(fen)子(zi)熒光(guang)(guang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)猝(cu)滅也很明顯(xian)，盡管(guan)發(fa)射的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)減(jian)(jian)少(shao)(shao)量(liang)小于(yu)(yu)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)SOPC LUV中觀(guan)察(cha)到(dao)(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)減(jian)(jian)少(shao)(shao)量(liang)（圖2，面(mian)(mian)板(ban)(ban)A和(he)B）。然而(er)(er)，當(dang)(dang)酸(suan)性磷(lin)脂(zhi)POPG存在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)于(yu)(yu)XPOPG）0.10時(shi)，Im中只有微(wei)不(bu)足道(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)變化(hua)(hua)是明顯(xian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，當(dang)(dang)XPOPG從0.20增(zeng)(zeng)加(jia)到(dao)(dao)(dao)0.40時(shi)，時(shi)間(jian)蛋白B導致Im以漸進的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)式(shi)增(zeng)(zeng)加(jia)，Im的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)初始增(zeng)(zeng)量(liang)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)大約(yue)2/1的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)POPG/時(shi)間(jian)蛋白B化(hua)(hua)學(xue)計(ji)量(liang)比(bi)下(xia)趨(qu)于(yu)(yu)穩定。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)達到(dao)(dao)(dao)飽和(he)響應(ying)之前，Im中線性增(zeng)(zeng)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)斜率隨(sui)著(zhu)XPOPG而(er)(er)增(zeng)(zeng)加(jia)（圖2，面(mian)(mian)板(ban)(ban)C）。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)POPG存在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)情(qing)況下(xia)，顳(nie)蛋白B也增(zeng)(zeng)加(jia)了(le)Ie。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)XPOPG）0.40時(shi)，Ie的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)值逐漸增(zeng)(zeng)加(jia)，直到(dao)(dao)(dao)顳(nie)蛋白B：脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)摩(mo)爾比(bi)為≈1：15，對(dui)(dui)應(ying)于(yu)(yu)≈1/6，而(er)(er)當(dang)(dang)超過該化(hua)(hua)學(xue)計(ji)量(liang)比(bi)時(shi)，Ie降低(di)。圖3，面(mian)(mian)板(ban)(ban)A中顯(xian)示了(le)由(you)于(yu)(yu)顳(nie)蛋白B引(yin)起的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)Ie/Im的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)變化(hua)(hua)。具體(ti)而(er)(er)言，SOPC LUV的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)Ie/Im增(zeng)(zeng)加(jia)了(le)1.1倍，而(er)(er)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)膽固醇(chun)（Xchol）0.10的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)存在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)下(xia)，觀(guan)察(cha)到(dao)(dao)(dao)Ie/Im的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)小變化(hua)(hua)，面(mian)(mian)板(ban)(ban)A）。將(jiang)XPOPG從0.10增(zeng)(zeng)加(jia)到(dao)(dao)(dao)0.20會逐漸增(zeng)(zeng)強(qiang)Ie/Im的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)增(zeng)(zeng)量(liang)。有趣的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)是，在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)XPOPG）0.40時(shi)，當(dang)(dang)時(shi)間(jian)蛋白B：脂(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)摩(mo)爾比(bi)為≈1:30.然而(er)(er)，在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)這(zhe)(zhe)一肽(tai)(tai)：脂(zhi)比(bi)之上，顳(nie)葉(xie)素B導致Ie/Im降低(di)，而(er)(er)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)這(zhe)(zhe)一肽(tai)(tai)：脂(zhi)比(bi)之上，Ie/Im的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)變化(hua)(hua)不(bu)顯(xian)著(zhu)≈1:6.

圖(tu)2：通過芘(bi)標(biao)記的磷脂(zhi)PPDPC（X）0.01的熒光評估顳(nie)葉素B對(dui)LUV中(zhong)脂(zhi)質動力(li)學的影響，分(fen)別顯示為(wei)(wei)芘(bi)單(dan)體(ti)和(he)準(zhun)分(fen)子(zi)發射強度Im（圖(tu)A），Ie（圖(tu)B）的變(bian)化，以(yi)及在RFIm中(zhong)達到飽和(he)反應(ying)之前Im增加(jia)的斜(xie)率（圖(tu)C）。脂(zhi)質體(ti)由SOPC組成，XPOPG為(wei)(wei)0（0）、0.10（9）、0.20（b）和(he)0.40（2），Xchol為(wei)(wei)0.10（3）。總體(ti)積為(wei)(wei)2 mL的5 mM Hepes，0.1 mM EDTA，pH 7.0，脂(zhi)質濃度為(wei)(wei)20μM。使(shi)用循(xun)環水浴將(jiang)溫度保持在25°C。每(mei)個數據點代表三次測量(liang)的平均(jun)值(zhi)。標(biao)準(zhun)偏差小于(yu)0.02（面(mian)板(ban)A和(he)B）和(he)0.004（面(mian)板(ban)C），為(wei)(wei)清晰起見，未顯示。

芘標記的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)質PPDPC的(de)(de)(de)(de)(de)Ie/Im增強通(tong)常被(bei)評估(gu)為是(shi)由于探針(zhen)的(de)(de)(de)(de)(de)側向(xiang)分(fen)離(li)(li)或脂(zhi)質側向(xiang)擴(kuo)散速(su)率增加(jia)所致(zhi)。為了(le)解(jie)決這兩種相互(hu)非排斥機制之間的(de)(de)(de)(de)(de)矛(mao)盾，我們測量了(le)膜(mo)中(zhong)DPH的(de)(de)(de)(de)(de)穩(wen)態熒光各(ge)向(xiang)異(yi)性r（圖(tu)3，面板B）。DPH是(shi)一(yi)種小(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)、疏水的(de)(de)(de)(de)(de)桿(gan)狀熒光團，其中(zhong)很大一(yi)部(bu)分(fen)位于雙層的(de)(de)(de)(de)(de)碳氫化(hua)合物區域(yu)，平(ping)行于膜(mo)脂(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)長軸。其發(fa)射(she)各(ge)向(xiang)異(yi)性可(ke)用于評估(gu)酰基(ji)鏈順序(xu)(xu)（有(you)關綜述，請參閱24）。增加(jia)脂(zhi)質堆積后，觀察到(dao)酰基(ji)鏈順序(xu)(xu)增加(jia)，從而(er)減少(shao)脂(zhi)質側向(xiang)擴(kuo)散（25，26）。顳葉(xie)素(su)B對SOPC和(he)SOPC/膽固(gu)醇（Xchol）0.10）LUVs的(de)(de)(de)(de)(de)r僅產生(sheng)了(le)微(wei)不(bu)足(zu)道的(de)(de)(de)(de)(de)變化(hua)（圖(tu)3，面板B）。因(yin)此(ci)(ci)，SOPC-luv的(de)(de)(de)(de)(de)酰基(ji)鏈順序(xu)(xu)沒(mei)有(you)變化(hua)以(yi)(yi)及Ie/Im的(de)(de)(de)(de)(de)增加(jia)表明(ming)PPDPC很可(ke)能富集(ji)到(dao)微(wei)域(yu)中(zhong)。隨著XPOPG的(de)(de)(de)(de)(de)增加(jia)，添加(jia)顳蛋白(bai)B后，脂(zhi)質堆積和(he)酰基(ji)鏈順序(xu)(xu)逐(zhu)漸增強。因(yin)此(ci)(ci)，膜(mo)橫向(xiang)擴(kuo)散的(de)(de)(de)(de)(de)增加(jia)不(bu)能導(dao)致(zhi)觀察到(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)Ie/Im和(he)顳葉(xie)素(su)B誘導(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)質分(fen)離(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)增加(jia)；即。，可(ke)以(yi)(yi)得出PPDPC在膜(mo)中(zhong)聚集(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)結論。然而(er)，當(dang)考慮淬火過程的(de)(de)(de)(de)(de)影響時，解(jie)釋(shi)變得更加(jia)復雜。

圖3：通(tong)過(guo)芘標(biao)記(ji)的(de)磷(lin)脂PPDPC（X）0.01）的(de)熒光(guang)和(he)DPH（X）0.002的(de)穩態發射(she)各(ge)(ge)向(xiang)異(yi)性r評(ping)估(gu)顳葉(xie)素B對LUV中脂質(zhi)動力學的(de)影(ying)響，顯示(shi)為具有XPOPG）0（0）、0.10（9）、0.20（B）和(he)0.40（2）的(de)SOPC脂質(zhi)體(ti)中歸一(yi)化準分子與單體(ti)比率(lv)r（Ie/Im）（圖A）和(he)各(ge)(ge)向(xiang)異(yi)性r（圖B）的(de)變化，Xchol）0.10（3）。每個數據(ju)點代表三次測量的(de)平均值。標(biao)準偏差(cha)小于0.02（面板(ban)A）和(he)0.004（面板(ban)B），為清楚起見，未顯示(shi)。否則情況如圖2圖例所示(shi)。

圖(tu)4：通過芘標(biao)記(ji)的磷脂PPDPC（X）0.01的熒光評估(gu)顳葉素L對LUV中(zhong)脂質(zhi)動力(li)學(xue)的影響(xiang)，分(fen)別顯示為芘單體(ti)(ti)和準分(fen)子發射強度Im（圖(tu)A）和Ie（圖(tu)B）的變化。脂質(zhi)體(ti)(ti)由SOPC組(zu)成，XPOPG為0（0）、0.10（9）、0.20（b）和0.40（2），Xchol為0.10（3）。每(mei)個數據點代表三次(ci)測量的平均值。標(biao)準偏差小于0.02，為清晰起見，未顯示。否則(ze)情況如(ru)圖(tu)2圖(tu)例所示。