堿(jian)性淀粉酶(mei)是一(yi)種在(zai)堿(jian)性環境(jing)（pH9.0~11.0）下穩(wen)定且(qie)可以(yi)通過裂解(jie)α-1,4-糖苷鍵(jian)高效水(shui)(shui)解(jie)淀粉的(de)(de)水(shui)(shui)解(jie)酶(mei)。堿(jian)性淀粉酶(mei)可以(yi)應(ying)用于紡(fang)(fang)(fang)織(zhi)退漿、洗滌劑添加等(deng)領域(yu)。研究發現，堿(jian)性淀粉酶(mei)在(zai)紡(fang)(fang)(fang)織(zhi)退漿領域(yu)中(zhong)應(ying)用可以(yi)節省大量(liang)時間、降(jiang)低(di)環境(jing)污染，同時可以(yi)將對(dui)紡(fang)(fang)(fang)織(zhi)織(zhi)物(wu)(wu)(wu)本身造(zao)成的(de)(de)損壞降(jiang)至最(zui)低(di)程度。這極大提高了紡(fang)(fang)(fang)織(zhi)物(wu)(wu)(wu)前處(chu)理過程中(zhong)的(de)(de)效率，實現最(zui)大生產經濟效益，是推(tui)動未(wei)來紡(fang)(fang)(fang)織(zhi)物(wu)(wu)(wu)前處(chu)理工藝快速發展的(de)(de)關鍵(jian)酶(mei)制劑之一(yi)。

國內外對堿(jian)性(xing)(xing)(xing)淀粉(fen)(fen)酶(mei)的(de)研究主要(yao)集中在(zai)生(sheng)產菌(jun)株篩選(xuan)、酶(mei)的(de)分(fen)離純化(hua)(hua)(hua)和(he)(he)酶(mei)學(xue)性(xing)(xing)(xing)質研究方面(mian)。堿(jian)性(xing)(xing)(xing)淀粉(fen)(fen)酶(mei)在(zai)紡織退(tui)漿工藝和(he)(he)洗滌劑添加過程中應用時，需(xu)(xu)要(yao)堿(jian)性(xing)(xing)(xing)淀粉(fen)(fen)酶(mei)具有強(qiang)耐(nai)氧(yang)化(hua)(hua)(hua)特性(xing)(xing)(xing)和(he)(he)高催(cui)化(hua)(hua)(hua)效率(lv)。但(dan)野生(sheng)型(xing)堿(jian)性(xing)(xing)(xing)淀粉(fen)(fen)酶(mei)的(de)耐(nai)氧(yang)化(hua)(hua)(hua)性(xing)(xing)(xing)能(neng)差(cha)，催(cui)化(hua)(hua)(hua)效率(lv)低，需(xu)(xu)要(yao)通過分(fen)子改(gai)造提高其耐(nai)氧(yang)化(hua)(hua)(hua)性(xing)(xing)(xing)能(neng)及(ji)催(cui)化(hua)(hua)(hua)效率(lv)。

本論(lun)文實(shi)現了堿(jian)性淀(dian)粉酶基因（Accession No. AY268953）分別(bie)在大腸(chang)桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢(bao)桿菌（Bacillus subtilis）、畢赤(chi)酵母（Pichia pastoris）表達(da)系統(tong)中的異源表達(da)，并在此(ci)基礎上通過對(dui)堿(jian)性淀(dian)粉酶進行分子(zi)改造提高了其耐氧化特性和催化效率。

主(zhu)要結果如(ru)下：

1.根據不同宿(su)主(zhu)(zhu)密碼子(zi)偏好性分別優化了堿性淀(dian)(dian)粉(fen)(fen)酶(mei)(mei)(mei)密碼子(zi)，并在宿(su)主(zhu)(zhu)E. coli、B.subtilis、P. pastoris中成(cheng)功(gong)表(biao)達(da)。純化后，測(ce)定(ding)堿性淀(dian)(dian)粉(fen)(fen)酶(mei)(mei)(mei)動力學參數(shu)，分析發現該酶(mei)(mei)(mei)的催化效率與已報道其他堿性淀(dian)(dian)粉(fen)(fen)酶(mei)(mei)(mei)相(xiang)比較(jiao)偏高，適(shi)合(he)進一步應用(yong)研究(jiu)。堿性淀(dian)(dian)粉(fen)(fen)酶(mei)(mei)(mei)的最(zui)適(shi)反應pH值(zhi)為9.5，穩(wen)定(ding)pH范圍為8.0~11.0。酶(mei)(mei)(mei)的最(zui)適(shi)反應溫(wen)度(du)為50℃，活化能（Ea）為36.1kJ/mol。酶(mei)(mei)(mei)在50和60℃溫(wen)度(du)下(xia)半衰期（t1/2）分別為15.5和3.2min，酶(mei)(mei)(mei)的熔解溫(wen)度(du)（Tm值(zhi)）為64.3℃。1mM Na~+對堿性淀(dian)(dian)粉(fen)(fen)酶(mei)(mei)(mei)酶(mei)(mei)(mei)活力有激活作(zuo)用(yong)，但(dan)其他金屬離子(zi)對酶(mei)(mei)(mei)活力均沒有促進作(zuo)用(yong)。非離子(zi)表(biao)面活性劑(ji)對堿性淀(dian)(dian)粉(fen)(fen)酶(mei)(mei)(mei)穩(wen)定(ding)性影(ying)響較(jiao)小(xiao)，但(dan)陰離子(zi)表(biao)面活性劑(ji)SDS（十二烷基硫酸(suan)鈉）可完全抑(yi)制酶(mei)(mei)(mei)的活性。液態(tai)洗(xi)滌劑(ji)和固態(tai)皂類洗(xi)滌劑(ji)對堿性淀(dian)(dian)粉(fen)(fen)酶(mei)(mei)(mei)酶(mei)(mei)(mei)活力抑(yi)制作(zuo)用(yong)較(jiao)強(qiang)，但(dan)固態(tai)洗(xi)衣粉(fen)(fen)對酶(mei)(mei)(mei)活力影(ying)響較(jiao)小(xiao)。

2.通過在線(xian)模擬(ni)軟件Swiss Model對堿(jian)性(xing)淀(dian)(dian)粉(fen)酶AmyK進行同(tong)源(yuan)模擬(ni)，獲得(de)堿(jian)性(xing)淀(dian)(dian)粉(fen)酶3-D結構。分析酶3-D結構后，確定了活(huo)性(xing)位(wei)點(dian)周圍5個關鍵甲硫氨酸(suan)殘基（Met145、Met214、Met229、Met247、Met317）。采用單點(dian)突(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)方式(shi)，將(jiang)關鍵氨基酸(suan)分別(bie)突(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)成亮(liang)氨酸(suan)后，突(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)體(ti)(ti)耐氧化性(xing)顯(xian)(xian)著提高，但僅突(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)體(ti)(ti)M247L催化效率有提高。同(tong)時，突(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)體(ti)(ti)M247L的pH穩(wen)(wen)定性(xing)和熱(re)穩(wen)(wen)定性(xing)增強(qiang)。單點(dian)突(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)對酶表(biao)面活(huo)性(xing)劑(ji)耐受性(xing)沒有顯(xian)(xian)著影響。突(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)體(ti)(ti)M247L與(yu)商業洗(xi)滌劑(ji)（洗(xi)衣粉(fen)）的兼(jian)容性(xing)增強(qiang)。復合突(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)后，突(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)體(ti)(ti)的耐氧化性(xing)顯(xian)(xian)著提高，特別(bie)是含有Met247位(wei)點(dian)突(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)方式(shi)產生的突(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)體(ti)(ti)。復合突(tu)(tu)(tu)(tu)變(bian)(bian)體(ti)(ti)M145-214L、M145-214-229L、M145-229-247L、M214-229-247L、M145-214-229-317L的底物結合能力(li)加強(qiang)。

3.基(ji)于同源模擬獲得(de)的(de)3-D結構，通過(guo)單(dan)點(dian)突(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)方(fang)式(shi)分(fen)別(bie)將5個(ge)關鍵氨基(ji)酸(suan)(suan)(suan)突(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)成蘇(su)氨酸(suan)(suan)(suan)、丙氨酸(suan)(suan)(suan)、絲氨酸(suan)(suan)(suan)、異亮氨酸(suan)(suan)(suan)。突(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)體的(de)耐(nai)氧(yang)化(hua)性(xing)(xing)顯著增強(qiang)。突(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)體M247T、M145I、M229T的(de)kcat/Km值分(fen)別(bie)提(ti)高(gao)至改造前酶的(de)1.3、1.5和(he)(he)(he)2.1倍(bei)。通過(guo)對單(dan)點(dian)突(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)體耐(nai)氧(yang)化(hua)和(he)(he)(he)催化(hua)效(xiao)率變(bian)(bian)(bian)(bian)化(hua)綜合分(fen)析，確定(ding)(ding)了8種(zhong)正(zheng)向單(dan)點(dian)突(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)方(fang)式(shi)（M145A、M145I、M214A、M229A、M229T、M247T、M247L、M317I）。通過(guo)上述8種(zhong)突(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)方(fang)式(shi)系統進行復合突(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)，共獲得(de)8個(ge)五(wu)點(dian)突(tu)變(bian)(bian)(bian)(bian)體。其中，M145I-214A-229T-247T-317I的(de)酶學(xue)性(xing)(xing)質提(ti)高(gao)最為(wei)顯著：kcat/Km值提(ti)高(gao)為(wei)改造前酶的(de)3.2倍(bei)；耐(nai)氧(yang)化(hua)性(xing)(xing)、耐(nai)堿性(xing)(xing)、熱穩(wen)定(ding)(ding)性(xing)(xing)、表面活性(xing)(xing)劑穩(wen)定(ding)(ding)性(xing)(xing)和(he)(he)(he)固態洗滌(di)劑兼容(rong)性(xing)(xing)均增強(qiang)。

4.將6條具有不同性(xing)(xing)質的(de)(de)(de)寡肽與(yu)(yu)堿性(xing)(xing)淀粉(fen)酶(mei)N端分別(bie)融(rong)合(he)(he)(he)(he)后(hou)(hou)，在(zai)(zai)宿主E. coli BL21（DE3）中(zhong)成(cheng)功表達(da)。融(rong)合(he)(he)(he)(he)寡肽1（AEAEAKAKAEAEAKAK）后(hou)(hou)，AmyK::OP1的(de)(de)(de)比酶(mei)活提高(gao)(gao)為(wei)融(rong)合(he)(he)(he)(he)前(qian)酶(mei)的(de)(de)(de)2.4倍(bei)。融(rong)合(he)(he)(he)(he)蛋白(bai)的(de)(de)(de)Km值(zhi)均(jun)減小，說明酶(mei)底物(wu)結合(he)(he)(he)(he)能力增強。AmyK::OP1的(de)(de)(de)kcat值(zhi)提高(gao)(gao)為(wei)融(rong)合(he)(he)(he)(he)前(qian)酶(mei)的(de)(de)(de)3.4倍(bei)；同時，AmyK::OP1的(de)(de)(de)kcat/Km值(zhi)提高(gao)(gao)為(wei)融(rong)合(he)(he)(he)(he)前(qian)酶(mei)的(de)(de)(de)5.4倍(bei)。融(rong)合(he)(he)(he)(he)后(hou)(hou)，融(rong)合(he)(he)(he)(he)蛋白(bai)的(de)(de)(de)耐(nai)堿性(xing)(xing)增強。寡肽1、3、4或5與(yu)(yu)堿性(xing)(xing)淀粉(fen)酶(mei)融(rong)合(he)(he)(he)(he)表達(da)后(hou)(hou)，酶(mei)的(de)(de)(de)最適反應溫度提高(gao)(gao)。融(rong)合(he)(he)(he)(he)蛋白(bai)AmyK::OP1的(de)(de)(de)熱穩定性(xing)(xing)和耐(nai)氧化性(xing)(xing)增強。洗衣(yi)粉(fen)對(dui)AmyK::OP1的(de)(de)(de)酶(mei)活力具有激活作用；同時，其他融(rong)合(he)(he)(he)(he)蛋白(bai)與(yu)(yu)洗衣(yi)粉(fen)的(de)(de)(de)兼(jian)容性(xing)(xing)也(ye)較高(gao)(gao)。融(rong)合(he)(he)(he)(he)蛋白(bai)在(zai)(zai)固態皂(zao)類和液態洗滌劑存在(zai)(zai)條件下穩定性(xing)(xing)均(jun)較低(di)。

5.基(ji)(ji)(ji)于對(dui)堿性(xing)淀(dian)(dian)(dian)粉(fen)(fen)(fen)酶(mei)(mei)(mei)(mei)結構區域(yu)和(he)(he)氨(an)基(ji)(ji)(ji)酸序列(lie)解析，確定(ding)了(le)(le)12種(zhong)酶(mei)(mei)(mei)(mei)C端(duan)或(huo)N端(duan)不同截(jie)(jie)(jie)(jie)斷(duan)(duan)(duan)方式(shi)，并在截(jie)(jie)(jie)(jie)斷(duan)(duan)(duan)突(tu)變體(ti)(ti)N端(duan)融合(he)(he)(he)(he)表達寡(gua)肽(tai)(tai)1，共產生了(le)(le)24個突(tu)變體(ti)(ti)。堿性(xing)淀(dian)(dian)(dian)粉(fen)(fen)(fen)酶(mei)(mei)(mei)(mei)C端(duan)或(huo)N端(duan)截(jie)(jie)(jie)(jie)斷(duan)(duan)(duan)后，突(tu)變體(ti)(ti)AmyKΔC500-587和(he)(he)AmyKΔC492-587的(de)比(bi)酶(mei)(mei)(mei)(mei)活(huo)分別(bie)提高(gao)為(wei)截(jie)(jie)(jie)(jie)斷(duan)(duan)(duan)前(qian)酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)3.2和(he)(he)2.7倍。AmyKΔC500-587和(he)(he)AmyKΔC492-587的(de)kcat值均提高(gao)為(wei)截(jie)(jie)(jie)(jie)斷(duan)(duan)(duan)前(qian)酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)2倍。AmyKΔC500-587和(he)(he)AmyKΔC492-587的(de)kcat/Km值分別(bie)提高(gao)為(wei)截(jie)(jie)(jie)(jie)斷(duan)(duan)(duan)前(qian)酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)3.4和(he)(he)2.6倍。截(jie)(jie)(jie)(jie)斷(duan)(duan)(duan)后N端(duan)寡(gua)肽(tai)(tai)融合(he)(he)(he)(he)突(tu)變體(ti)(ti)AmyKΔC500-587::SOP和(he)(he)AmyKΔC492-587::SOP的(de)kcat/Km值分別(bie)提高(gao)為(wei)截(jie)(jie)(jie)(jie)斷(duan)(duan)(duan)融合(he)(he)(he)(he)前(qian)酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)29.7和(he)(he)22.5倍。C端(duan)淀(dian)(dian)(dian)粉(fen)(fen)(fen)結合(he)(he)(he)(he)區域(yu)對(dui)堿性(xing)淀(dian)(dian)(dian)粉(fen)(fen)(fen)酶(mei)(mei)(mei)(mei)降解玉(yu)米淀(dian)(dian)(dian)粉(fen)(fen)(fen)具有(you)重要意義，但(dan)(dan)N端(duan)序列(lie)截(jie)(jie)(jie)(jie)斷(duan)(duan)(duan)對(dui)堿性(xing)淀(dian)(dian)(dian)粉(fen)(fen)(fen)酶(mei)(mei)(mei)(mei)降解玉(yu)米淀(dian)(dian)(dian)粉(fen)(fen)(fen)能(neng)力沒(mei)有(you)影(ying)(ying)響。寡(gua)肽(tai)(tai)1融合(he)(he)(he)(he)表達對(dui)C端(duan)截(jie)(jie)(jie)(jie)斷(duan)(duan)(duan)突(tu)變體(ti)(ti)降解玉(yu)米淀(dian)(dian)(dian)粉(fen)(fen)(fen)具有(you)促進作用，但(dan)(dan)對(dui)N端(duan)截(jie)(jie)(jie)(jie)斷(duan)(duan)(duan)突(tu)變體(ti)(ti)降解玉(yu)米淀(dian)(dian)(dian)粉(fen)(fen)(fen)的(de)能(neng)力基(ji)(ji)(ji)本沒(mei)有(you)影(ying)(ying)響。隨機截(jie)(jie)(jie)(jie)斷(duan)(duan)(duan)和(he)(he)截(jie)(jie)(jie)(jie)斷(duan)(duan)(duan)后融合(he)(he)(he)(he)表達對(dui)堿性(xing)淀(dian)(dian)(dian)粉(fen)(fen)(fen)酶(mei)(mei)(mei)(mei)pH穩(wen)(wen)定(ding)性(xing)和(he)(he)溫度(du)穩(wen)(wen)定(ding)性(xing)幾乎沒(mei)有(you)影(ying)(ying)響。突(tu)變體(ti)(ti)AmyKΔC500-587、AmyKΔC492-587、AmyKΔC500-587::SOP、AmyKΔC492-587::SOP的(de)耐氧(yang)化性(xing)增強。隨機截(jie)(jie)(jie)(jie)斷(duan)(duan)(duan)和(he)(he)截(jie)(jie)(jie)(jie)斷(duan)(duan)(duan)后融合(he)(he)(he)(he)表達對(dui)堿性(xing)淀(dian)(dian)(dian)粉(fen)(fen)(fen)酶(mei)(mei)(mei)(mei)表面活(huo)性(xing)劑穩(wen)(wen)定(ding)性(xing)沒(mei)有(you)顯著影(ying)(ying)響。突(tu)變體(ti)(ti)AmyKΔC500-587、AmyKΔC492-587、AmyKΔC500-587::SOP、AmyKΔC492-587::SOP與固(gu)態洗(xi)滌劑（洗(xi)衣(yi)粉(fen)(fen)(fen)）的(de)兼容性(xing)增強。