化學修飾法測序原理

化學試劑處理(li)末段(duan)DNA片(pian)段(duan)，造成堿(jian)基的(de)(de)特異性(xing)切割(ge)，產生一組(zu)具(ju)有各(ge)種(zhong)不同(tong)長(chang)度的(de)(de)DNA鏈的(de)(de)反應(ying)(ying)混合(he)物，經凝(ning)膠電泳分(fen)離(li)。化學切割(ge)反應(ying)(ying)：包括(kuo)堿(jian)基的(de)(de)修(xiu)飾，修(xiu)飾的(de)(de)堿(jian)基從其糖(tang)環上轉移出(chu)去在(zai)失去堿(jian)基的(de)(de)糖(tang)環處DNA斷裂。

Sanger法測序的原理

就是利(li)用一(yi)(yi)種(zhong)DNA聚合酶來延伸結合在(zai)待定序列(lie)模板上(shang)的(de)(de)引(yin)物。直到摻入一(yi)(yi)種(zhong)鏈(lian)終止(zhi)核(he)苷(gan)酸(suan)為止(zhi)。每一(yi)(yi)次序列(lie)測定由一(yi)(yi)套(tao)四(si)個單獨的(de)(de)反應(ying)(ying)構成(cheng)，每個反應(ying)(ying)含(han)有所有四(si)種(zhong)脫(tuo)氧(yang)核(he)苷(gan)酸(suan)三磷酸(suan)(dNTP)，并混(hun)入限量的(de)(de)一(yi)(yi)種(zhong)不(bu)同的(de)(de)雙脫(tuo)氧(yang)核(he)苷(gan)三磷酸(suan)(ddNTP)。由于(yu)ddNTP缺乏延伸所需要的(de)(de)3-OH基團，使延長的(de)(de)寡聚核(he)苷(gan)酸(suan)選擇性(xing)地(di)在(zai)G、A、T或C處終止(zhi)。終止(zhi)點(dian)由反應(ying)(ying)中相應(ying)(ying)的(de)(de)雙脫(tuo)氧(yang)而定。每一(yi)(yi)種(zhong)dNTPs和ddNTPs的(de)(de)相對濃度可(ke)以(yi)調整，使反應(ying)(ying)得到一(yi)(yi)組長幾百至幾千(qian)堿基的(de)(de)鏈(lian)終止(zhi)產物。它們具有共同的(de)(de)起始點(dian)，但終止(zhi)在(zai)不(bu)同的(de)(de)的(de)(de)核(he)苷(gan)酸(suan)上(shang)，可(ke)通過(guo)高分(fen)辨率(lv)變性(xing)凝(ning)膠(jiao)電泳分(fen)離大小不(bu)同的(de)(de)片段，凝(ning)膠(jiao)處理后可(ke)用X-光(guang)膠(jiao)片放射自顯影或非同位素標(biao)記進行檢(jian)測。

DNA測序的規律

 生成(cheng)互相獨立的若干組帶放射性(xing)標(biao)記的寡核苷酸，每組寡核苷酸都(dou)有固定(ding)的起(qi)點(dian)，但卻隨機終止于特定(ding)的一種(zhong)或者多種(zhong)殘基上。

由于DNA上(shang)的每(mei)一(yi)(yi)個堿(jian)基出(chu)現在(zai)可變終止端的機(ji)會均等，因(yin)此上(shang)述每(mei)一(yi)(yi)組(zu)產物都(dou)是一(yi)(yi)些寡(gua)核苷酸混(hun)合物，這(zhe)些寡(gua)核苷酸的長(chang)度(du)由某一(yi)(yi)種特定堿(jian)基在(zai)原DNA全片段上(shang)的位置所決定。

在可(ke)以(yi)區(qu)分長度僅差一個核(he)(he)苷酸(suan)的(de)不同DNA分子(zi)的(de)條(tiao)件下，對各組(zu)寡核(he)(he)苷酸(suan)進行電(dian)泳分析，只要把幾組(zu)寡核(he)(he)苷酸(suan)加樣于(yu)測(ce)序凝(ning)膠中若干個相鄰(lin)的(de)泳道上，即(ji)可(ke)從凝(ning)膠的(de)放(fang)射自影片上直接讀出DNA上的(de)核(he)(he)苷酸(suan)順序。