材料和方法

化學品

煤(mei)油(you)和(he)正十六烷(wan)(wan) (99%) 是(shi) Alfa Aesar (Karlsruhe, Germany) 的產品。 菜籽油(you)購(gou)(gou)自超(chao)市。 原(yuan)油(you)由 ENI Norge 提供。 苯(ben)并 (a) 芘粉末(mo) (>96%) 和(he)苯(ben)并 (a) 芘溶(rong)(rong)液(ye)（100 ng/μl 的環己(ji)烷(wan)(wan)溶(rong)(rong)液(ye)）購(gou)(gou)自 Sigma Aldrich（美國(guo)密蘇里州）。 溶(rong)(rong)劑甲基(ji)叔丁基(ji)醚(mi) (MTBE)、庚烷(wan)(wan)和(he)環己(ji)烷(wan)(wan)是(shi) Merck KGaA（德(de)國(guo)達姆(mu)施(shi)塔特(te)）的產品。 除(chu)非(fei)另(ling)有說明，否則所用(yong)化學品均(jun)為分析級。

沙子和海水樣品

從(cong)沿(yan)挪威海(hai)岸線（包(bao)括(kuo)朗格松、赫瓦勒、Tj?me、羅弗敦和奧斯陸港(gang)）的歷(li)史石(shi)油烴污染地點收集(ji)的沙子(zi)/土壤樣本和海(hai)水用于分(fen)離烴降解細菌。

媒體

將微生物維持在 Marine Agar 2216 (Difco) 或 Marine Broth 2216 (Difco) 上(shang)。 煤油或其(qi)他特定碳源上(shang)的細(xi)菌(jun)生長在改良的 Bushnell Haas (MBH) 培(pei)養基上(shang)進行(xing)，該培(pei)養基含有(you)（在 1 升海水中）： KH2PO4，（1 克(ke)）； K2HPO4，（1 克(ke)）； NH4NO3，（1 克(ke)）； MgSO4·7H2O（0.2克(ke)）； CaCl2·2H2O（0.02克(ke)）； FeCl3·6H2O（0.05 克(ke)）。[11]

烴類降解菌的分離

通過 0.2 μm 過濾(lv)器無菌過濾(lv) 400 ml 的(de)海水。 然后(hou)將過濾(lv)器放入(ru) 250 毫(hao)升(sheng)錐形燒瓶中(zhong)，該燒瓶中(zhong)預裝了(le) 50 毫(hao)升(sheng) MBH 肉湯。 對于土壤/沙子樣品，使用(yong) 5 克土壤/沙子。 根據污染(ran)場(chang)地，補(bu)充 1% (w/w) 的(de)過濾(lv)滅菌柴油(you)或原(yuan)油(you)作為碳和(he)能源。 然后(hou)將接種的(de)燒瓶在(zai) 13°C、160 rpm 下培(pei)養(yang)(yang) 3 周，并(bing)在(zai)相同(tong)培(pei)養(yang)(yang)基中(zhong)傳代培(pei)養(yang)(yang)兩次。 隨(sui)后(hou)將第三次富集培(pei)養(yang)(yang)物在(zai) MBH 中(zhong)稀(xi)(xi)釋到適當的(de)稀(xi)(xi)釋度，并(bing)鋪在(zai)海洋(yang)瓊(qiong)脂 2216 上。這產生(sheng)了(le) 84 個具有不(bu)同(tong)形態的(de)菌落。 選擇不(bu)同(tong)的(de)菌落并(bing)再次在(zai)海洋(yang)瓊(qiong)脂 2216 上劃線以獲(huo)得純培(pei)養(yang)(yang)物。

篩選表面活性特性

從斯瓦爾巴(ba)群島海灘沉積物(wu)(wu)中(zhong)分(fen)(fen)離(li)出的(de)能夠利用(yong)煤(mei)油作為(wei)碳源和(he)能源的(de)挪威漁業(ye)科學學院培(pei)養(yang)物(wu)(wu)保藏中(zhong)心的(de) 93 株(zhu)新的(de)碳氫化(hua)合物(wu)(wu)降解菌株(zhu)與(yu) 93 株(zhu)菌株(zhu)一(yi)起篩選了 SAC 生產能力。 菌株(zhu)在(zai)海洋瓊(qiong)脂(zhi)平板上(shang)于 13°C 培(pei)養(yang) 1 周(zhou)。 隨后將每種分(fen)(fen)離(li)物(wu)(wu)的(de)單菌落接(jie)種在(zai)試管(guan)中(zhong)，加入 3 ml MBH 培(pei)養(yang)基并補(bu)充有 1% (w/w) 葡(pu)(pu)萄糖(tang)或煤(mei)油。 將管(guan)在(zai) 13°C (180 rpm) 下用(yong)葡(pu)(pu)萄糖(tang)培(pei)養(yang) 1 周(zhou)，用(yong)煤(mei)油培(pei)養(yang) 4 周(zhou)。 通過離(li)心（10,000 rpm 10 分(fen)(fen)鐘）將細(xi)(xi)胞(bao)與(yu)培(pei)養(yang)液(ye)分(fen)(fen)離(li)。 對完整培(pei)養(yang)物(wu)(wu)和(he)無細(xi)(xi)胞(bao)上(shang)清液(ye)進行生物(wu)(wu)表面活(huo)性劑和(he)乳化(hua)特性的(de)測(ce)定，如下所述。

SAC 生產的光學畸變測定

從每個菌株的培養上清(qing)液中(zhong)取出(chu) 100 μl 體積并(bing)加(jia)入到平底 96 微孔(kong)板中(zhong)。 然后將這(zhe)些板放(fang)在一(yi)張帶(dai)有黑色網格的紙上并(bing)進(jin)行檢(jian)查(cha)。 網格的光學畸(ji)變為 SAC 的存在提供了(le)定(ding)性分(fen)析。 [12]

用于 SAC 生產的油擴散試驗

將(jiang)(jiang)蒸(zheng)餾(liu)水 (3 ml) 裝入(ru) 24 孔(kong)微孔(kong)板的每個孔(kong)中。 將(jiang)(jiang) 10 μl 原(yuan)油加入(ru)蒸(zheng)餾(liu)水中，并將(jiang)(jiang)約 10 μl 細菌培養物逐漸加入(ru)油層中心。 如果培養物中存在 SAC，則(ze)油將(jiang)(jiang)被置(zhi)換并形成清潔(jie)區。 還包括分別使用(yong) 10 μl 蒸(zheng)餾(liu)水和 10 μl Tween 80 (0.1% w/w) 的陰性和陽(yang)性對照(zhao)。 [13]

乳化試驗

如(ru) Batista 等(deng)人所(suo)述測(ce)量無細胞上(shang)清液(ye)(ye)的乳(ru)(ru)化(hua)活(huo)性。 [14]。 選擇在初始定(ding)性篩選中產生穩(wen)定(ding)混濁乳(ru)(ru)液(ye)(ye)層的上(shang)清液(ye)(ye)進行定(ding)量乳(ru)(ru)化(hua)測(ce)定(ding)，在試管（φ 13 mm × 16 mm）中使(shi)用 5 ml 上(shang)清液(ye)(ye)和 5 ml 煤油。 然后(hou)(hou)將混合(he)物渦(wo)旋2分鐘并在室溫(wen)下(xia)靜置。 24 小時后(hou)(hou)估計相對(dui)乳(ru)(ru)液(ye)(ye)體積 (EV %) 與(yu)總液(ye)(ye)體體積。

表面張力和臨界膠束濃度 (CMC) 測量

根(gen)據 Du Nouy 方法，使用 EZ-Piplus 張(zhang)(zhang)(zhang)力計（Kibron，芬蘭）測(ce)量(liang)培養物(wu)和(he)培養物(wu)上(shang)清液(ye)的(de)表面張(zhang)(zhang)(zhang)力。 [15] 提取的(de) SAC（見下文(wen)）重新懸浮在蒸餾水(shui)中并(bing)稀釋到不(bu)同的(de)濃度(du)。 測(ce)量(liang)稀釋液(ye)的(de)表面張(zhang)(zhang)(zhang)力以確(que)定(ding)CMC。 CMC 是表面張(zhang)(zhang)(zhang)力值(zhi)達(da)到最低水(shui)平時 SAC 的(de)最低濃度(du)。

生物表面活性劑的生產和提取

SAC 陽性(xing)菌(jun)株在(zai) 50 ml 海洋肉湯中(zhong)預培養(yang) 24 小(xiao)時。 然后(hou)通過在(zai) 5°C 下(xia)以(yi) 4500 rpm 離心(xin) 20 分(fen)鐘收獲細胞，并用(yong) MBH 培養(yang)基洗滌 3 次。 將(jiang)細胞沉淀(dian)重新懸浮在(zai) 100 ml MBH 培養(yang)基中(zhong)，該培養(yang)基補(bu)充有 2% (w/w) 過濾滅菌(jun)的煤油(you)(you)、正(zheng)十六烷或高壓(ya)滅菌(jun)的菜籽油(you)(you)。 將(jiang)燒瓶在(zai)旋轉振(zhen)蕩器中(zhong)以(yi) 160 rpm 在(zai) 20°C 下(xia)孵育 7 天(tian)。

為了在(zai)(zai)(zai)靜(jing)息(xi)細(xi)胞條(tiao)件下(xia)生產 SAC，將細(xi)菌分離物在(zai)(zai)(zai) 50 ml 海洋肉(rou)湯中預培(pei)(pei)養 24 小時(shi)。 然(ran)后通過在(zai)(zai)(zai) 5°C 下(xia)以(yi) 4500 rpm 離心(xin) 20 分鐘收獲培(pei)(pei)養物，并用含有 K2HPO4 1 g 的磷酸鹽緩沖液洗(xi)滌 3 次； KH2PO4 1 g 和(he) NaCl 19.7 g。 將細(xi)胞沉(chen)淀(dian)（0.6 g）重新(xin)懸浮(fu)在(zai)(zai)(zai)補(bu)充有 2% (w/w) 過濾滅菌煤油的 50 ml 磷酸鹽緩沖液中，隨(sui)后將細(xi)胞懸浮(fu)液在(zai)(zai)(zai) 160 rpm 和(he) 20°C 下(xia)孵育 5 天。

根據 Kuyukina 等人的(de)(de)方法(fa)提取生物(wu)表面(mian)活性劑。 [16] 稍作修改。 將等體(ti)積的(de)(de) MTBE 添加到(dao)(dao)培養物(wu)中。 將混合物(wu)在(zai)(zai) 45 kHz 下(xia)超聲 5 分(fen)(fen)鐘(zhong)，隨后(hou)在(zai)(zai)旋轉振(zhen)蕩器上以(yi)(yi) 200 rpm、20°C 振(zhen)蕩 3 小時，然(ran)后(hou)在(zai)(zai) 4°C 下(xia)以(yi)(yi) 4500 rpm 離(li)心 5 分(fen)(fen)鐘(zhong)以(yi)(yi)分(fen)(fen)離(li)兩相。 將頂部溶(rong)劑層轉移到(dao)(dao)干(gan)凈的(de)(de)燒杯中并在(zai)(zai) 37°C 下(xia)干(gan)燥。

16S rRNA基因序列分析

選(xuan)定(ding)的(de)分(fen)(fen)離株在(zai) 16°C 下在(zai)海(hai)洋肉湯中培(pei)養 24 小時。 對(dui)于(yu) 16S rRNA 基(ji)因(yin)擴(kuo)增，使(shi)(shi)(shi)用(yong) InstaGene 矩陣試劑(ji)(ji)盒(he)（Bio-Rad，英國）按照制造(zao)商(shang)的(de)說明分(fen)(fen)離細菌(jun)染(ran)色體 DNA。 16S rRNA 基(ji)因(yin)使(shi)(shi)(shi)用(yong) PCR 方法(fa)用(yong) 1 U Taq DNA 聚合酶(mei) (VWR) 和(he)通用(yong)引(yin)物(wu) 27F (5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) 和(he) 1492R (5' -TACGGYTACCTTGTTACGACTT) 進行擴(kuo)增。 根據制造(zao)商(shang)的(de)方案，使(shi)(shi)(shi)用(yong) BigDye 終止子(zi)試劑(ji)(ji)盒(he) 3.1 版(ban)（Applied Biosystems）對(dui) 16S rRNA 基(ji)因(yin)進行測序，使(shi)(shi)(shi)用(yong)通用(yong)引(yin)物(wu) 515F（5' -GTGCCAGCAGCCGCGGTAA）。 PCR 測序后(hou)，使(shi)(shi)(shi)用(yong) Applied Biosystems 3130xl 基(ji)因(yin)分(fen)(fen)析儀對(dui)樣品進行測序。 使(shi)(shi)(shi)用(yong) RDP (//rdp.cme.msu.edu) 提供的(de) SEQMATCH 程序進行分(fen)(fen)類學(xue)分(fen)(fen)類。 使(shi)(shi)(shi)用(yong)國家(jia)生物(wu)技術信息中心 (NCBI) 的(de) BLAST 2.2.12 版(ban)檢查序列(lie)同源性。 16S rRNA 基(ji)因(yin)序列(lie)以登錄號提交給 GenBank。

正十六烷的生物降解

來自(zi)紅球菌(jun)屬的(de)(de)(de)(de)生物表(biao)(biao)(biao)面活(huo)性(xing)劑(ji)(ji)(ji)。 研究了菌(jun)株 LF-22 對正(zheng)(zheng)十六(liu)(liu)烷(wan)(wan)生物降解的(de)(de)(de)(de)影響。 將過濾除菌(jun)的(de)(de)(de)(de)正(zheng)(zheng)十六(liu)(liu)烷(wan)(wan) (1 ml) 添加到 100 ml 高(gao)壓滅菌(jun)的(de)(de)(de)(de)海(hai)水中(zhong)(zhong)，并補充有 KH2PO4 (1 gl-1)； K2HPO4 (1 gl-1 ); NH4NO3 (1 gl-1 ) 和(he)(he)(he)(he)(he) FeCl3·6H2O (0.05 gl-1 )。 將提取的(de)(de)(de)(de)生物表(biao)(biao)(biao)面活(huo)性(xing)劑(ji)(ji)(ji)以終濃(nong)度(du)為 CMC 的(de)(de)(de)(de)兩倍添加到燒(shao)瓶(ping)(ping)中(zhong)(zhong)。 Yarrowia spp. 的(de)(de)(de)(de)混合酵母(mu)培養物 LS-DO。 作(zuo)為正(zheng)(zheng)十六(liu)(liu)烷(wan)(wan)降解劑(ji)(ji)(ji)接種在(zai)燒(shao)瓶(ping)(ping)中(zhong)(zhong)。 LS-DO 能夠利用正(zheng)(zheng)十六(liu)(liu)烷(wan)(wan)和(he)(he)(he)(he)(he)煤油作(zuo)為唯一的(de)(de)(de)(de)碳源(yuan)(yuan)和(he)(he)(he)(he)(he)能源(yuan)(yuan)。 樣(yang)品(pin) 1 是僅包(bao)含(han)正(zheng)(zheng)十六(liu)(liu)烷(wan)(wan)的(de)(de)(de)(de)對照（表(biao)(biao)(biao) 4）。 樣(yang)品(pin) 2 含(han)有正(zheng)(zheng)十六(liu)(liu)烷(wan)(wan)和(he)(he)(he)(he)(he)生物表(biao)(biao)(biao)面活(huo)性(xing)劑(ji)(ji)(ji)。 樣(yang)品(pin) 3 補充有正(zheng)(zheng)十六(liu)(liu)烷(wan)(wan)和(he)(he)(he)(he)(he)耶氏酵母(mu)屬。 LS-DO。 樣(yang)品(pin) 4 與樣(yang)品(pin) 3 相似，但添加了生物表(biao)(biao)(biao)面活(huo)性(xing)劑(ji)(ji)(ji)。 將燒(shao)瓶(ping)(ping)在(zai) 180 rpm、13°C 下孵(fu)育 17 天(tian)。 在(zai)開始和(he)(he)(he)(he)(he) 13 天(tian)和(he)(he)(he)(he)(he) 17 天(tian)后測量(liang)(liang)培養物在(zai) 600 nm 處的(de)(de)(de)(de)光密(mi)度(du)、表(biao)(biao)(biao)面張力和(he)(he)(he)(he)(he)培養物的(de)(de)(de)(de)正(zheng)(zheng)十六(liu)(liu)烷(wan)(wan)濃(nong)度(du)。 使(shi)用分(fen)配重量(liang)(liang)法測量(liang)(liang)培養物中(zhong)(zhong)正(zheng)(zheng)十六(liu)(liu)烷(wan)(wan)的(de)(de)(de)(de)濃(nong)度(du)。 [17]

海洋細菌中生物表面活性物質——摘要、介紹

海洋細菌中生物表面活性物質——材料和方法

海洋細菌中生物表面活性物質——結果和討論

海洋細菌中生物表面活性物質——結論、致謝！