摘要

細(xi)胞(bao)的(de)(de)(de)(de)(de)糖酵解(jie)(jie)代謝產生(sheng)質(zhi)子，這些質(zhi)子通(tong)過(guo)轉運蛋白從細(xi)胞(bao)質(zhi)中去除，從而在(zai)相(xiang)(xiang)鄰的(de)(de)(de)(de)(de)整體溶液(ye)和(he)細(xi)胞(bao)膜表(biao)(biao)面(mian)之間(jian)產生(sheng)pH差(cha)。因(yin)此(ci)，由于不(bu)(bu)(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)糖萼和(he)質(zhi)子產生(sheng)能力(li)，組織細(xi)胞(bao)具(ju)(ju)有(you)不(bu)(bu)(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)面(mian)pHs。在(zai)這項研究中，我(wo)們(men)使(shi)用具(ju)(ju)有(you)pH依賴活(huo)性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)裂(lie)解(jie)(jie)肽(tai)(tai)作為探針，證明了細(xi)胞(bao)表(biao)(biao)面(mian)pH在(zai)肽(tai)(tai)-細(xi)胞(bao)相(xiang)(xiang)互作用和(he)肽(tai)(tai)活(huo)化中的(de)(de)(de)(de)(de)作用。適當地(di)，所選擇的(de)(de)(de)(de)(de)肽(tai)(tai)能夠感知細(xi)胞(bao)上特定的(de)(de)(de)(de)(de)pH區(qu)域，因(yin)此(ci)對(dui)(dui)(dui)具(ju)(ju)有(you)不(bu)(bu)(bu)同表(biao)(biao)面(mian)pH的(de)(de)(de)(de)(de)組織細(xi)胞(bao)表(biao)(biao)現出不(bu)(bu)(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)活(huo)性(xing)(xing)(xing)。對(dui)(dui)(dui)于特定的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)，隨著質(zhi)子通(tong)道調(diao)節器調(diao)節細(xi)胞(bao)表(biao)(biao)面(mian)pH值(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)升(sheng)高(gao)或降(jiang)低，pH敏(min)感肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)活(huo)性(xing)(xing)(xing)相(xiang)(xiang)應地(di)發生(sheng)變化。機(ji)理研究表(biao)(biao)明，細(xi)胞(bao)表(biao)(biao)面(mian)pH通(tong)過(guo)改變膜結合pH敏(min)感肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)二級結構(gou)和(he)聚集狀(zhuang)態直接影響肽(tai)(tai)插(cha)入膜。根(gen)據正常-癌(ai)細(xi)胞(bao)對(dui)(dui)(dui)之間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)細(xi)胞(bao)表(biao)(biao)面(mian)pH差(cha)設計(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)pH敏(min)感裂(lie)解(jie)(jie)肽(tai)(tai)對(dui)(dui)(dui)癌(ai)細(xi)胞(bao)具(ju)(ju)有(you)良(liang)好的(de)(de)(de)(de)(de)選擇性(xing)(xing)(xing)。因(yin)此(ci)，細(xi)胞(bao)表(biao)(biao)面(mian)pHs可能為設計(ji)具(ju)(ju)有(you)高(gao)細(xi)胞(bao)特異性(xing)(xing)(xing)和(he)選擇性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)治療肽(tai)(tai)提供新的(de)(de)(de)(de)(de)機(ji)會。

介紹

細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)的(de)(de)(de)(de)糖(tang)酵(jiao)解代謝產(chan)生(sheng)質(zhi)(zhi)子(zi)(zi)，這些(xie)質(zhi)(zhi)子(zi)(zi)通過(guo)轉運蛋(dan)白(bai)(bai)（如(ru)Na+/H+交換異構體(ti)1（NHE1）（1,2））從細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)質(zhi)(zhi)中去除。在(zai)不(bu)限(xian)制質(zhi)(zhi)子(zi)(zi)擴散的(de)(de)(de)(de)情(qing)況下，噴射(she)出的(de)(de)(de)(de)質(zhi)(zhi)子(zi)(zi)將(jiang)在(zai)無限(xian)的(de)(de)(de)(de)外部溶液中被(bei)稀釋。然而(er)，哺乳動物(wu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)表(biao)面(mian)(mian)覆蓋著一層致密的(de)(de)(de)(de)碳水(shui)化合物(wu)，由膜(mo)(mo)錨定糖(tang)蛋(dan)白(bai)(bai)和(he)糖(tang)脂的(de)(de)(de)(de)共軛低(di)聚糖(tang)鏈組成，稱(cheng)為糖(tang)萼（3）。由于(yu)這些(xie)帶(dai)負(fu)電(dian)(dian)的(de)(de)(de)(de)大分子(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)存(cun)在(zai)，質(zhi)(zhi)子(zi)(zi)在(zai)膜(mo)(mo)-水(shui)界面(mian)(mian)上的(de)(de)(de)(de)擴散確實受到(dao)帶(dai)負(fu)電(dian)(dian)膜(mo)(mo)表(biao)面(mian)(mian)水(shui)的(de)(de)(de)(de)低(di)介(jie)電(dian)(dian)常(chang)數（e）的(de)(de)(de)(de)限(xian)制。因此，噴射(she)出的(de)(de)(de)(de)質(zhi)(zhi)子(zi)(zi)很容易擴散到(dao)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)表(biao)面(mian)(mian)，但(dan)不(bu)知(zhi)何故(gu)無法迅速(su)與體(ti)積(ji)平衡。據估計，該勢(shi)壘可(ke)使(shi)膜(mo)(mo)表(biao)面(mian)(mian)的(de)(de)(de)(de)質(zhi)(zhi)子(zi)(zi)濃度比本(ben)體(ti)中的(de)(de)(de)(de)質(zhi)(zhi)子(zi)(zi)濃度高10-6 M，從而(er)在(zai)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)表(biao)面(mian)(mian)和(he)相鄰本(ben)體(ti)溶液之間產(chan)生(sheng)pH差（4,5）。理論上，細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)表(biao)面(mian)(mian)的(de)(de)(de)(de)特定pH區可(ke)以通過(guo)影響細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)表(biao)面(mian)(mian)電(dian)(dian)荷(he)、細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)表(biao)面(mian)(mian)的(de)(de)(de)(de)離子(zi)(zi)積(ji)累、細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)膜(mo)(mo)電(dian)(dian)位、藥物(wu)吸收以及肽/蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)與受體(ti)的(de)(de)(de)(de)結(jie)合對細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)產(chan)生(sheng)重大影響。不(bu)幸的(de)(de)(de)(de)是，細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)表(biao)面(mian)(mian)pHs的(de)(de)(de)(de)生(sheng)物(wu)學重要性和(he)潛(qian)在(zai)的(de)(de)(de)(de)藥學意義被(bei)忽(hu)視了。

我們知道，肽(tai)轉變為結(jie)合(he)平(ping)面(mian)和插入細(xi)胞(bao)膜是生(sheng)物(wu)活(huo)性(xing)肽(tai)發揮其生(sheng)物(wu)活(huo)性(xing)的關(guan)鍵步驟（6）。在本研(yan)究中，選(xuan)擇一組具有pH依賴性(xing)細(xi)胞(bao)裂(lie)解(jie)活(huo)性(xing)的裂(lie)解(jie)肽(tai)（pH敏(min)感裂(lie)解(jie)肽(tai)）作為探(tan)針，通過(guo)檢測細(xi)胞(bao)表(biao)面(mian)pHs影(ying)響的肽(tai)-細(xi)胞(bao)相互作用和肽(tai)活(huo)化來評估細(xi)胞(bao)表(biao)面(mian)pHs的藥學意義(yi)。

方法和材料

材料

肽（純度>90%）由Genescript公司(si)（美(mei)國(guo)新澤西州皮(pi)斯卡(ka)塔韋）合(he)成。將肽溶(rong)解(jie)在含(han)有10%二甲(jia)基(ji)亞砜(feng)（DMSO）的水中，形成5.0 mM儲備(bei)溶(rong)液。使用合(he)適(shi)的細(xi)(xi)胞培養基(ji)，從(cong)(cong)儲備(bei)溶(rong)液中逐漸稀(xi)釋制(zhi)備(bei)肽工作溶(rong)液。活/死細(xi)(xi)菌(jun)染色試劑盒購自(zi)Invitrogen Life Technologies（美(mei)國(guo)加利福尼亞州卡(ka)爾斯巴德）。所有其他化學品均(jun)從(cong)(cong)Sigma-Aldrich Co.（美(mei)國(guo)密蘇(su)里州圣路易斯）購買。

細胞培養

所有(you)細(xi)(xi)胞均(jun)取自(zi)美國(guo)類型培養(yang)(yang)物收集中(zhong)心（ATCC）。A549和CHO-K1細(xi)(xi)胞在F12K中(zhong)生(sheng)長(chang)，NIH/3T3細(xi)(xi)胞在DMEM中(zhong)生(sheng)長(chang)，CCD-Lu13細(xi)(xi)胞在MEM中(zhong)生(sheng)長(chang)。所有(you)培養(yang)(yang)基均(jun)添加10%胎(tai)牛血清（FBS）。細(xi)(xi)胞在37°C、5%CO2的增濕空氣(qi)中(zhong)培養(yang)(yang)。

肽的pH敏感性

如(ru)(ru)前所述（6），在(zai)(zai)負載鈣黃(huang)綠素的(de)大單膜囊泡(pao)（LUV）上測(ce)試肽(tai)(tai)的(de)裂解(jie)活(huo)(huo)性(xing)。通過(guo)將激發(fa)和發(fa)射波(bo)長分(fen)(fen)別(bie)設置為(wei)485和530 nm，使(shi)(shi)用熒光(guang)微孔板讀取(qu)器監測(ce)肽(tai)(tai)誘導的(de)鈣黃(huang)綠素泄漏（通過(guo)熒光(guang)強度的(de)增加反映）。從LUV釋放的(de)鈣黃(huang)綠素表示(shi)為(wei)F/F0，其中F0和F分(fen)(fen)別(bie)表示(shi)在(zai)(zai)不(bu)存(cun)在(zai)(zai)和存(cun)在(zai)(zai)肽(tai)(tai)的(de)情況下負載鈣黃(huang)綠素的(de)LUV的(de)熒光(guang)強度。已經(jing)證明，pH敏感(gan)裂解(jie)肽(tai)(tai)的(de)活(huo)(huo)性(xing)變(bian)化(hua)通常發(fa)生在(zai)(zai)狹窄的(de)pH范圍(wei)內，即(ji)所謂的(de)肽(tai)(tai)轉變(bian)pH值，即(ji)當肽(tai)(tai)的(de)凈電(dian)(dian)荷為(wei)零（6）時的(de)pH值，如(ru)(ru)圖1所示(shi)。使(shi)(shi)用納(na)米試劑（6）測(ce)定肽(tai)(tai)的(de)過(guo)渡pH值。簡單地說，用不(bu)同pH值（pH=5.0–9.0）的(de)PBS稀釋來自儲備溶(rong)液（水中5mM）的(de)肽(tai)(tai)。對新制備的(de)肽(tai)(tai)溶(rong)液（40 lM）進行(xing)短暫(zan)（60秒）的(de)超聲(sheng)處(chu)理。使(shi)(shi)用zeta納(na)米分(fen)(fen)析儀在(zai)(zai)超聲(sheng)處(chu)理后立即(ji)測(ce)量肽(tai)(tai)溶(rong)液的(de)zeta電(dian)(dian)位(wei)。

圖1：過渡pH=7.35的肽CL-7的pH依(yi)賴性膜裂解活性。

細胞表面pHs的測量

共有2.59105個細(xi)胞接(jie)種在膠(jiao)原涂層(ceng)的(de)(de)(de)(de)覆蓋(gai)玻璃上并(bing)培養過(guo)(guo)夜。細(xi)胞在無(wu)血清培養基中用(yong)熒(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)素(su)結(jie)合麥胚(pei)凝集素(su)（WGA）（12.5 lM）染色30 min，然后將(jiang)(jiang)蓋(gai)玻璃組裝(zhuang)到FCS2流(liu)動室系統（BioTechs Inc.，Butler，PA，USA）。使用(yong)視頻成像技術(shu)測(ce)(ce)量pH值(zhi)(zhi)(zhi)。將(jiang)(jiang)蓋(gai)玻璃置于共焦顯微(wei)鏡（LSM510；美國紐約桑伍德卡爾蔡(cai)司有限公司）的(de)(de)(de)(de)臺上，并(bing)以(yi)0.1ml/min的(de)(de)(de)(de)速度(du)連(lian)續超(chao)灌注預(yu)熱（37°C）Hepes緩沖林格(ge)溶液（122.5mmNaCl、5.4mmKCl、0.8mmMgCl2、1.2mmCaCl2、1.0mmNaH2PO4·2H2O、5.0mm葡萄(tao)糖、10mmHEPES；pH=7.4）波長在458和488 nm之間交替，而發射的(de)(de)(de)(de)熒(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)強度(du)記錄(lu)在560 nm以(yi)上。根據在458和488 nm處測(ce)(ce)得的(de)(de)(de)(de)發射熒(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)強度(du)計(ji)算(suan)出比率。因此，該測(ce)(ce)量實際上與給定感(gan)興趣區(qu)域(yu)中激發的(de)(de)(de)(de)染料量無(wu)關(guan)，并(bing)表示(shi)局部質子濃度(du)（1）。以(yi)1.0秒的(de)(de)(de)(de)間隔(ge)測(ce)(ce)量熒(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)強度(du)，平(ping)均測(ce)(ce)量10次，并(bing)通過(guo)(guo)減去位于測(ce)(ce)量的(de)(de)(de)(de)感(gan)興趣區(qu)域(yu)旁邊的(de)(de)(de)(de)對照區(qu)域(yu)的(de)(de)(de)(de)背(bei)景(jing)(jing)強度(du)來(lai)校正(zheng)背(bei)景(jing)(jing)熒(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)。在每(mei)個實驗結(jie)束時，通過(guo)(guo)使用(yong)不(bu)同(tong)pH值(zhi)(zhi)(zhi)（pH=8.5、8.0、7.4、7.0、6.5和6.0）的(de)(de)(de)(de)改良(liang)(liang)Ringer溶液（125 mM KCl、1 mM MgCl2、1 mM CaCl2、20 mM Hepes和10 mM nigericin）連(lian)續超(chao)濾池，校準pH測(ce)(ce)量值(zhi)(zhi)(zhi)。熒(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)素(su)在6-10的(de)(de)(de)(de)pH范圍內(nei)具有良(liang)(liang)好的(de)(de)(de)(de)熒(ying)(ying)(ying)(ying)光(guang)(guang)強度(du)-pH相關(guan)性。

細胞表面電荷的測定

將細(xi)胞(bao)接種于(yu)濃(nong)度(du)(du)為5 9 104個細(xi)胞(bao)/mL的細(xi)胞(bao)培養瓶(ping)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)。培養48小時后(hou)，從培養瓶(ping)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)刮下(xia)細(xi)胞(bao)，用PBS洗滌，并(bing)在(zai)0.25 M蔗(zhe)糖溶(rong)液(ye)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)重新懸浮(fu)至(zhi)最終濃(nong)度(du)(du)為106個細(xi)胞(bao)/mL。然后(hou)用1%甲(jia)(jia)苯胺藍染色細(xi)胞(bao)懸浮(fu)液(ye)90分(fen)鐘。之后(hou)，用聚1,1-二甲(jia)(jia)基(ji)-3,5-二甲(jia)(jia)基(ji)哌啶氯化(hua)(hua)銨（CFC）溶(rong)液(ye)滴定細(xi)胞(bao)。根據先前出(chu)版物（7）中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)描述的程序，通過將總電荷與電池數(shu)量歸(gui)一化(hua)(hua)來計算(suan)電池表面電荷。

肽圓二色光譜的獲取

肽的圓二色譜(pu)（CD）光(guang)譜(pu)記錄在Jasco J-710分光(guang)旋(xuan)光(guang)儀上（Jasco公司，美國馬里(li)蘭州伊斯(si)頓(dun)）（6）。在25°C條(tiao)件(jian)下，在光(guang)程(cheng)長度為1.0-mm的帶帽石英(ying)光(guang)學池(chi)中掃描(miao)CD光(guang)譜(pu)。以1.0 nm的間(jian)隔(ge)從250至190 nm收集數據，每個波(bo)長的積(ji)分時間(jian)為2秒。對每次測量的五到十(shi)次掃描(miao)進行平均(jun)、平滑、背(bei)景減(jian)去，并轉換(huan)為平均(jun)殘余(yu)摩(mo)爾橢圓度[h]（度cm2 dmol?1）。CDPRO軟件(jian)用于分析從CD分光(guang)旋(xuan)光(guang)儀獲得(de)的數據。

肽誘導細胞裂解的測定

在(zai)暴露(lu)于肽之(zhi)前，在(zai)96孔板(ban)（5 9 103個細胞/孔）上過夜培養的細胞用PBS洗(xi)滌三次。在(zai)孵育60分鐘(zhong)后，通(tong)過使用乳酸脫(tuo)氫(qing)酶(mei)試劑(ji)盒測量受損細胞的乳酸脫(tuo)氫(qing)酶(mei)（LDH）釋放，定量評估肽誘導的細胞膜(mo)損傷。通(tong)過將參(can)考波長設置為690 nm，使用微孔板(ban)讀取(qu)器(qi)（美國(guo)VT威努(nu)斯基Biotek Inc.）測量490 nm處(chu)的吸(xi)光度。對照空(kong)白對照組和(he)100%裂解(jie)對照組，結果均標準(zhun)化為細胞死亡(wang)百分比。

肽誘導細胞膜損傷的動力學

將新鮮(xian)胰蛋白酶化的(de)人(ren)肺(fei)癌A549細胞(bao)(bao)接種于膠原涂層的(de)八孔玻璃室(shi)內（2 9 104個細胞(bao)(bao)/孔），并培養過夜。試(shi)驗前，用(yong)PBS清洗細胞(bao)(bao)三(san)次(ci)，并用(yong)活/死(si)染色試(shi)劑盒(he)染色15分鐘(zhong)。添加肽(tai)后，使用(yong)蔡司(si)LSM510共焦顯微鏡（卡爾蔡司(si)公司(si)）在不同時間點記錄細胞(bao)(bao)圖(tu)(tu)像。激發(fa)波長固定在488 nm，發(fa)射波長分別設置為505–530 nm（活細胞(bao)(bao)）和(he)560 nm（死(si)細胞(bao)(bao)）。計算捕獲的(de)細胞(bao)(bao)圖(tu)(tu)像中綠色像素(su)占總綠色和(he)紅色像素(su)的(de)百分比，以估(gu)計細胞(bao)(bao)膜(mo)完整性（8）。

肽與脂膜的相互作用

使用組裝在微(wei)槽(cao)X上的(de)脂質(zhi)單層研究肽與細胞膜的(de)相互(hu)作(zuo)用（芬蘭赫爾辛基Kibron公司）（6）。將DPPC/膽(dan)固(gu)醇/DPPS（50/10/2.5）的(de)脂質(zhi)混合(he)物溶(rong)(rong)解在3:1氯(lv)仿：甲醇中，形成(cheng)100 lM脂質(zhi)溶(rong)(rong)液。向四孔聚(ju)四氟(fu)乙烯板(ban)中添加(jia)1.0 mL PBS，然后滴一滴脂質(zhi)溶(rong)(rong)液。有(you)機溶(rong)(rong)劑蒸發后，在水面形成(cheng)脂質(zhi)單層。通過特氟(fu)隆(long)板(ban)的(de)側孔將肽溶(rong)(rong)液添加(jia)到亞相后，立即(ji)記(ji)錄肽誘(you)導的(de)表面張力變化(hua)。

pH敏感肽對正常細胞和癌細胞的毒性

使用MTT[3-（4,5-二(er)甲基噻唑(zuo)-2-基）-2,5-二(er)苯基四(si)唑(zuo)溴(xiu)化鹽]分析，在(zai)癌-正常對（A549和(he)CCD-13Lu）上比較pH敏感(gan)和(he)pH不(bu)敏感(gan)裂(lie)解肽(tai)對正常和(he)癌細胞的(de)細胞毒性。簡而言之，將(jiang)完整培(pei)養(yang)基中的(de)細胞加入96孔(kong)板（5 9 103個細胞/孔(kong)）中，并(bing)在(zai)37°C下(xia)培(pei)養(yang)14–16小(xiao)(xiao)時(shi)。洗(xi)滌后，用含有(you)不(bu)同濃度(du)肽(tai)的(de)無血清培(pei)養(yang)基喂(wei)養(yang)細胞，并(bing)在(zai)37°C下(xia)培(pei)養(yang)2小(xiao)(xiao)時(shi)。之后，向(xiang)每(mei)個孔(kong)中加入10 lL MTT（5 mg/mL）。培(pei)養(yang)4小(xiao)(xiao)時(shi)后，通(tong)過(guo)用含有(you)5%異丙醇和(he)0.1%HCl的(de)10%SDS溶液溶解福爾馬贊并(bing)在(zai)570 nm（9）處測量吸光度(du)來測定細胞活力。

肽在溶液中的自組裝和聚集特性

使用熒(ying)光(guang)探針1-苯(ben)胺基萘-8-磺酸（1,8-ANS）（6,10）估(gu)計(ji)肽(tai)在(zai)溶液中自組裝形成(cheng)肽(tai)聚(ju)集(ji)體。通(tong)過將激發波長設置為369 nm，在(zai)熒(ying)光(guang)微孔板閱讀(du)器（Biotek Inc.）上記(ji)錄了460–500 nm處由肽(tai)聚(ju)集(ji)引起的(de)1,8-ANS（20 lM）熒(ying)光(guang)發射光(guang)譜增加。

 使用zeta納米分析儀測量肽溶液在不同pH下的粒(li)徑(jing)和zeta電位(wei)變化。在每次測量之前(qian)，肽溶液經過短(duan)暫（60秒(miao)）的超聲處理(li)。

利用(yong)(yong)掃(sao)描電(dian)子顯(xian)微鏡（SEM）研究了肽(tai)聚集體的(de)形態。將(jiang)肽(tai)溶液(ye)裝載到硅(gui)片(pian)上并孵育(yu)30分鐘。用(yong)(yong)去離子水洗滌后(hou)，硅(gui)片(pian)上的(de)肽(tai)樣品(pin)涂上金(jin)。使用(yong)(yong)Auriga模塊化橫梁工作站（卡爾蔡(cai)司公司）獲取(qu)SEM圖像。