摘要

底物特(te)異性是表(biao)征(zheng)酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)一個關(guan)(guan)鍵參數(shu)，它直接關(guan)(guan)系到(dao)酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)應用潛(qian)力。商品化(hua)的(de)(de)(de)(de)Lecitase Ultra已(yi)被廣泛用于(yu)石油(you)脫(tuo)膠(jiao)過(guo)程中，以特(te)異性水解(jie)原(yuan)油(you)中的(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)，但其(qi)對各種(zhong)(zhong)磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)特(te)異性仍不(bu)清楚。在(zai)(zai)(zai)本(ben)研(yan)究中，采(cai)用單層技術，在(zai)(zai)(zai)不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)表(biao)面壓(ya)力條件下(xia)(xia)(xia)表(biao)征(zheng)了超(chao)乳糖酸(suan)(suan)酶(mei)(mei)對不(bu)同(tong)種(zhong)(zhong)類磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)選擇性。超(chao)乳糖酸(suan)(suan)酶(mei)(mei)對各種(zhong)(zhong)磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)水解(jie)活(huo)性高度依(yi)賴于(yu)單層膜(mo)的(de)(de)(de)(de)表(biao)面壓(ya)力。在(zai)(zai)(zai)相(xiang)同(tong)的(de)(de)(de)(de)表(biao)面壓(ya)力（25mN/m）下(xia)(xia)(xia)，在(zai)(zai)(zai)所有(you)磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)單層膜(mo)的(de)(de)(de)(de)液體(ti)冷凝狀態(tai)下(xia)(xia)(xia)，超(chao)卵磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)酶(mei)(mei)對不(bu)同(tong)單分子磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)膜(mo)的(de)(de)(de)(de)偏好順序為PE>CL>PS>PI>PC。在(zai)(zai)(zai)測試的(de)(de)(de)(de)表(biao)面壓(ya)力范圍內，未(wei)觀察到(dao)鞘磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)水解(jie)活(huo)性。目前(qian)的(de)(de)(de)(de)研(yan)究提供(gong)了關(guan)(guan)于(yu)Lecitase Ultra對各種(zhong)(zhong)磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)選擇性偏好順序的(de)(de)(de)(de)基(ji)本(ben)信(xin)息，這(zhe)是以前(qian)未(wei)知的(de)(de)(de)(de)，并為更好地利用這(zhe)種(zhong)(zhong)酶(mei)(mei)在(zai)(zai)(zai)石油(you)工業中提供(gong)了額外的(de)(de)(de)(de)信(xin)息。

實際應用

據我(wo)們(men)所知，我(wo)們(men)已經報(bao)道(dao)了應(ying)用單(dan)層技術研(yan)究(jiu)超乳糖酸酶對(dui)各種天然磷脂(zhi)的底物選擇性(xing)。這項研(yan)究(jiu)直接(jie)有(you)(you)助于該(gai)酶在(zai)(zai)工(gong)業(ye)中的應(ying)用。此外(wai)，我(wo)們(men)試圖證(zheng)明(ming)單(dan)層技術對(dui)于評估某(mou)些天然底物的酶活性(xing)是非常有(you)(you)效和簡單(dan)的，并且應(ying)該(gai)在(zai)(zai)界面酶工(gong)程領域做出更大的貢獻。

圖形摘要

利用單層(ceng)技(ji)術表征(zheng)超(chao)乳糖酸酶對不(bu)同磷脂的界面催化(hua)性能。

1、介紹

Lecitase Ultra是(shi)藍綠假單胞菌脂肪酶(mei)（TLL）和尖孢鐮刀菌脂肪酶(mei)（FOL）的(de)(de)(de)(de)嵌合體[1]，具有相(xiang)當高的(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂酶(mei)活(huo)性和脂肪酶(mei)活(huo)性[2]。這種酶(mei)完全基于其(qi)(qi)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂酶(mei)活(huo)性，能夠水解(jie)油(you)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂，并通過形成溶血磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂和甘(gan)油(you)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂將其(qi)(qi)去除(chu)，從而成功地用于植物油(you)的(de)(de)(de)(de)脫膠(jiao)[3,4]。正(zheng)如(ru)我們所(suo)知(zhi)，不(bu)同(tong)來源的(de)(de)(de)(de)原油(you)中(zhong)(zhong)(zhong)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂的(de)(de)(de)(de)組成和含(han)量存在顯(xian)著差異：例(li)如(ru)，原油(you)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)卵磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂通常(chang)含(han)有20%的(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂酰(xian)膽堿（PC）、15%的(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂酰(xian)乙醇胺（PE）、20%的(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂酰(xian)肌醇（PI）、5%的(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂酸（PA）和其(qi)(qi)他(ta)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂[5]。因此(ci)，Lecitase Ultra對(dui)不(bu)同(tong)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂的(de)(de)(de)(de)選(xuan)擇(ze)性是(shi)實際應(ying)用中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)一個重要參考指標(biao)，這反(fan)過來又(you)與應(ying)添加的(de)(de)(de)(de)酶(mei)量以及脫膠(jiao)過程中(zhong)(zhong)(zhong)所(suo)需的(de)(de)(de)(de)反(fan)應(ying)時間直接相(xiang)關。因此(ci)，獲得這種酶(mei)對(dui)天然磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)脂的(de)(de)(de)(de)選(xuan)擇(ze)性信息尤(you)為重要。然而，仍(reng)然缺乏對(dui)這方面的(de)(de)(de)(de)深(shen)入(ru)了(le)解(jie)。

脂(zhi)肪酶作為一(yi)種界面(mian)(mian)酶，催化不溶(rong)性底物與(yu)水(shui)之間(jian)的(de)(de)界面(mian)(mian)水(shui)解反應(ying)[6]。因此，脂(zhi)肪分解的(de)(de)催化反應(ying)與(yu)各種界面(mian)(mian)現象有關(guan)(guan)，并強烈依(yi)賴于界面(mian)(mian)上存在(zai)的(de)(de)脂(zhi)質基質的(de)(de)結構組織[6-8]。為了(le)獲得有關(guan)(guan)酶對各種磷脂(zhi)選擇(ze)性的(de)(de)適(shi)當信(xin)息，選擇(ze)合適(shi)的(de)(de)測試方法(fa)至關(guan)(guan)重要，應(ying)該是(shi)首要考慮的(de)(de)問題(ti)。

單層(ceng)技術是研究空氣/水(shui)界(jie)面(mian)(mian)上酶-脂(zhi)(zhi)質相互(hu)作用(yong)的(de)(de)(de)最(zui)通(tong)(tong)用(yong)的(de)(de)(de)實驗(yan)系統，已被(bei)用(yong)于通(tong)(tong)過(guo)相對表面(mian)(mian)活性來比(bi)較(jiao)脂(zhi)(zhi)肪酶的(de)(de)(de)底物選擇性[9]。使用(yong)單層(ceng)技術進行酶表征有幾個優點。首先(xian)，底物和酶只需要少量的(de)(de)(de)物質。因此，我們可(ke)(ke)以以非常低的(de)(de)(de)成本(ben)獲得酶的(de)(de)(de)活性信息。其(qi)次，可(ke)(ke)以改(gai)變(bian)(bian)表面(mian)(mian)組分(fen)(fen)的(de)(de)(de)分(fen)(fen)子(zi)堆積(ji)，并且(qie)可(ke)(ke)以連續監測脂(zhi)(zhi)質或蛋白質從(cong)界(jie)面(mian)(mian)的(de)(de)(de)釋放或轉移到(dao)界(jie)面(mian)(mian)的(de)(de)(de)情況。第三(san)，與傳(chuan)統的(de)(de)(de)pH-stat方(fang)法相比(bi)，該方(fang)法的(de)(de)(de)高靈(ling)敏度(du)(du)已通(tong)(tong)過(guo)實驗(yan)得到(dao)驗(yan)證[10,11]。最(zui)后，反應(ying)的(de)(de)(de)物理(li)化學(xue)參(can)數，如(ru)溫度(du)(du)、側壓、分(fen)(fen)子(zi)密度(du)(du)、離子(zi)條件(jian)等，可(ke)(ke)以在很寬的(de)(de)(de)范(fan)圍(wei)內方(fang)便(bian)地(di)改(gai)變(bian)(bian)，并且(qie)可(ke)(ke)以以?精度(du)(du)分(fen)(fen)析結構[12]。因此，單分(fen)(fen)子(zi)層(ceng)是研究界(jie)面(mian)(mian)酶反應(ying)的(de)(de)(de)合適模型(xing)。到(dao)目前為止，不同(tong)種類的(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)肪酶，甚(shen)至磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)酶（包括磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)酶A2、C和D）已經通(tong)(tong)過(guo)使用(yong)這種方(fang)法進行了(le)表征[11-14]。

本(ben)文首次采用單層技術對商品化超乳糖酸酶(mei)的(de)(de)底(di)物選擇性進(jin)行(xing)了表(biao)征。目前的(de)(de)結果(guo)不僅提(ti)供了對酶(mei)底(di)物選擇性的(de)(de)透徹(che)理解，而且為酶(mei)在石油(you)工(gong)業中的(de)(de)具(ju)體(ti)用途提(ti)供了詳(xiang)細信息。

2、材料和方法

2.1材料

商業Lecitase Ultra由(you)丹(dan)麥巴格斯瓦爾德諾維(wei)信(xin)A/S提供，直接測試，無(wu)需進一步純(chun)化(hua)。L-α-磷脂(zhi)酰肌醇(chun)（PI，純(chun)度(du)≥1,2-二酰基-sn-甘油(you)-3-磷酸(suan)-L-絲氨酸(suan)（PS，純(chun)度(du)≥97%），L-α-磷脂(zhi)酰乙醇(chun)胺（PE，純(chun)度(du)≥1,2-二油(you)基-sn-甘油(you)-3-磷酸(suan)膽堿（PC，純(chun)度(du)≥97%），心磷脂(zhi)（CL，純(chun)度(du)）≥鞘磷脂(zhi)（SM，純(chun)度(du)）≥98%）和β-環糊(hu)精從Sigma-Aldrich（密蘇里州圣路易斯）購買(mai)。HPLC級氯(lv)仿購自凱美爾化(hua)學試劑有限(xian)公(gong)司（天津）。使用Millipore（馬薩(sa)諸塞(sai)州貝(bei)德福德）Milli-Q水系(xi)統凈化(hua)水。所(suo)有其他攝(she)政(zheng)王(wang)都是(shi)分析(xi)級的。

2.2單分子薄膜實驗

2.2.1表面壓力-面積等溫線

使用(yong)(yong)帶有Langmuir-Teflon槽(cao)（206 mm×59 mm）的(de)商(shang)用(yong)(yong)單層(ceng)系統（芬蘭赫爾辛基(ji)Kibron的(de)微(wei)槽(cao)X）和兩個屏障的(de)對稱壓(ya)(ya)縮(suo)(suo)，記(ji)錄不同磷(lin)脂(zhi)(zhi)單層(ceng)的(de)壓(ya)(ya)縮(suo)(suo)等溫(wen)(wen)線。實驗在(zai)(zai)室溫(wen)(wen)（25℃）下(xia)進行。通過使用(yong)(yong)microsyringe（Hamilton Co.，Reno，NV）將不同磷(lin)脂(zhi)(zhi)的(de)氯仿儲備溶液滴在(zai)(zai)50 mM檸檬酸緩(huan)沖液（pH 5.0）亞(ya)相(xiang)上形成單層(ceng)（Hamilton Co.，Reno，NV）。15分鐘后，以2.5 mm/min的(de)速率連(lian)(lian)續(xu)壓(ya)(ya)縮(suo)(suo)所需(xu)組合物的(de)單層(ceng)。表面(mian)(mian)壓(ya)(ya)力是用(yong)(yong)附著在(zai)(zai)表面(mian)(mian)的(de)金屬絲(si)探針(zhen)測(ce)量(liang)的(de)。連(lian)(lian)續(xu)記(ji)錄表面(mian)(mian)壓(ya)(ya)力與表面(mian)(mian)積(ji)（π-A）等溫(wen)(wen)線。只要(yao)需(xu)要(yao)，膠片就被壓(ya)(ya)縮(suo)(suo)到(dao)崩潰壓(ya)(ya)力。每次運行重復三次，保持π-A等溫(wen)(wen)線的(de)標準偏差(cha)小于4?2。

2.2.2使(shi)用一個(ge)"零級(ji)(ji)"槽（由(you)(you)一個(ge)圓形(xing)反(fan)應(ying)室(shi)(shi)(shi)和兩個(ge)儲(chu)液(ye)(ye)室(shi)(shi)(shi)（182mm×40mm）組成）進行了(le)Lecitase Ultra的(de)(de)(de)(de)動(dong)(dong)力學(xue)水(shui)解活性(xing)計算。反(fan)應(ying)室(shi)(shi)(shi)的(de)(de)(de)(de)直(zhi)徑為21 mm，面積(ji)為346 mm2。這兩種隔室(shi)(shi)(shi)通過一個(ge)小的(de)(de)(de)(de)表(biao)面通道（寬0.5厘(li)米(mi)）相互連(lian)接。該方(fang)法的(de)(de)(de)(de)原(yuan)理之前(qian)由(you)(you)Verger和De Haas[15]描(miao)述。在目前(qian)的(de)(de)(de)(de)工作(zuo)中(zhong)(zhong)，用毫Q水(shui)制(zhi)備50 mM檸(ning)檬酸(suan)緩沖(chong)(chong)液(ye)(ye)（pH 5.0），并(bing)通過0.45μm微(wei)孔膜過濾(lv)。在50 mM檸(ning)檬酸(suan)緩沖(chong)(chong)液(ye)(ye)（pH 5.0）亞相上涂抹幾微(wei)升(sheng)氯仿(fang)磷脂溶(rong)液(ye)(ye)，直(zhi)到達到所需的(de)(de)(de)(de)初始表(biao)面壓(ya)(ya)力（πi），制(zhi)備單(dan)(dan)層(ceng)。由(you)(you)恒壓(ya)(ya)器自動(dong)(dong)驅動(dong)(dong)的(de)(de)(de)(de)移動(dong)(dong)式屏障在儲(chu)層(ceng)上來回移動(dong)(dong)，以壓(ya)(ya)縮(suo)并(bing)保(bao)持表(biao)面壓(ya)(ya)力（π）恒定(ding)。為了(le)確保(bao)水(shui)解反(fan)應(ying)中(zhong)(zhong)產生的(de)(de)(de)(de)長鏈脂肪酸(suan)能夠溶(rong)解在水(shui)中(zhong)(zhong)，按照Mosbah等(deng)人的(de)(de)(de)(de)建議，將β-環糊(hu)精(jing)（0.6 mg/ml）注(zhu)入反(fan)應(ying)室(shi)(shi)(shi)。[10]。然后將10μL酶溶(rong)液(ye)(ye)注(zhu)入反(fan)應(ying)室(shi)(shi)(shi)的(de)(de)(de)(de)亞相以開始反(fan)應(ying)。如前(qian)所述，對數據進行了(le)相應(ying)的(de)(de)(de)(de)分析[15,16]。活性(xing)顯示為單(dan)(dan)位(wei)時間、單(dan)(dan)位(wei)反(fan)應(ying)室(shi)(shi)(shi)面積(ji)和"零級(ji)(ji)"槽中(zhong)(zhong)每毫升(sheng)酶水(shui)解的(de)(de)(de)(de)底物(wu)摩(mo)爾數（摩(mo)爾數cm-2.min-1.mL-1）。所有分析測定(ding)均(jun)一式三份進行。結果(guo)以平均(jun)標準偏(pian)差（SD）的(de)(de)(de)(de)形(xing)式清(qing)楚地呈現(xian)。