3.結果和討論

通(tong)(tong)過(guo)CD光(guang)譜（圓(yuan)二色(se)光(guang)譜和(he)支持信(xin)息中(zhong)的圖S3）和(he)表(biao)面(mian)壓力(li)測量（圖S4）對HSA-TR和(he)野生型HSA進行(xing)比較(jiao)表(biao)明，染料標記僅輕微干擾HSA的二級結構和(he)疏(shu)水性。通(tong)(tong)過(guo)Langmuir-Schaefer技術和(he)AFM，我(wo)們證明了(le)在AWI處形成的蛋白質(zhi)膜可(ke)轉移到云母表(biao)面(mian)，并且類(lei)似(si)于一層(ceng)蛋白質(zhi)層(ceng)厚(～3 nm）用于HSA-TR和(he)HSA（圖S5）。這與(yu)先前(qian)的中(zhong)子反射率(lv)研(yan)究(jiu)（建議為單層(ceng)）非常一致(zhi)。16因此(ci)，最小標記、接近天然的HSA為通(tong)(tong)過(guo)熒光(guang)顯微鏡研(yan)究(jiu)AWI組(zu)裝提供了(le)有用的模(mo)型蛋白質(zhi)樣品(pin)。

在(zai)(zai)圖(tu)(tu)(tu)1中(zhong)，HSA-TR溶(rong)解在(zai)(zai)PBS中(zhong)（離(li)(li)子強(qiang)度(du)=193 mM），并在(zai)(zai)前面(mian)(mian)所(suo)述的(de)(de)小(xiao)室(shi)裝置中(zhong)成(cheng)像(xiang)（圖(tu)(tu)(tu)1A）。當HSA-TR（[HSATR]）的(de)(de)濃度(du)大于(yu)或(huo)等于(yu)0.050 mg/mL時，通過共聚焦顯(xian)微(wei)鏡觀(guan)察到均勻(yun)的(de)(de)熒(ying)光層(ceng)，如圖(tu)(tu)(tu)1B所(suo)示(shi)。光學分(fen)辨率為(wei)～0.2μm，4倍(bei)變焦圖(tu)(tu)(tu)像(xiang)（圖(tu)(tu)(tu)1C）顯(xian)示(shi)界(jie)面(mian)(mian)層(ceng)沒有特殊結(jie)構(gou)(gou)。然而，當[HSA-TR]小(xiao)于(yu)或(huo)等于(yu)0.025 mg/mL時，在(zai)(zai)界(jie)面(mian)(mian)處觀(guan)察到高度(du)不均勻(yun)結(jie)構(gou)(gou)，如圖(tu)(tu)(tu)1D所(suo)示(shi)。放(fang)大圖(tu)(tu)(tu)像(xiang)（圖(tu)(tu)(tu)1E）顯(xian)示(shi)HSA-TR組裝成(cheng)微(wei)米(mi)大小(xiao)的(de)(de)分(fen)形(xing)結(jie)構(gou)(gou)。XZ平面(mian)(mian)圖(tu)(tu)(tu)像(xiang)進(jin)一步證(zheng)實了不同的(de)(de)結(jie)構(gou)(gou)，圖(tu)(tu)(tu)1F中(zhong)觀(guan)察到厚度(du)均勻(yun)的(de)(de)熒(ying)光層(ceng)，而圖(tu)(tu)(tu)1G中(zhong)觀(guan)察到不連續的(de)(de)熒(ying)光層(ceng)。我們(men)的(de)(de)結(jie)果(guo)表明(ming)，在(zai)(zai)PBS中(zhong)離(li)(li)子強(qiang)度(du)為(wei)193mm的(de)(de)條件下，表面(mian)(mian)飽和(he)(he)體積溶(rong)液濃度(du)（CB sat）在(zai)(zai)0.025和(he)(he)0.050 mg/mL之(zhi)間。在(zai)(zai)CB sat以(yi)下，吸附的(de)(de)蛋白(bai)質不能(neng)完全覆(fu)蓋AWI，因此(ci)允(yun)許(xu)在(zai)(zai)界(jie)面(mian)(mian)處形(xing)成(cheng)蛋白(bai)質結(jie)構(gou)(gou)域。以(yi)前使用(yong)張力測定法(fa)(fa)和(he)(he)橢偏法(fa)(fa)的(de)(de)報告發現(xian)，覆(fu)蓋AWI的(de)(de)BSA臨界(jie)濃度(du)在(zai)(zai)10-2和(he)(he)10-1 mg/mL之(zhi)間，13這與我們(men)的(de)(de)結(jie)果(guo)非(fei)常吻合(he)。

盡管蛋(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)(zhi)吸附領(ling)域的(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)究人(ren)(ren)員普(pu)遍(bian)接受CB sat的(de)(de)(de)(de)(de)概念，13,34但(dan)很(hen)少有研(yan)究揭示了濃(nong)度(du)(du)低于(yu)WCB sat的(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)裝蛋(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)微觀結構。Powers等(deng)人(ren)(ren)報(bao)告了在(zai)(zai)AWI上觀察到(dao)由兩親性肽形(xing)成的(de)(de)(de)(de)(de)相結構域。23 Lee等(deng)人(ren)(ren)最近利用(yong)微流變學進行的(de)(de)(de)(de)(de)一(yi)項研(yan)究表明，在(zai)(zai)相對較低的(de)(de)(de)(de)(de)濃(nong)度(du)(du)下，AWI的(de)(de)(de)(de)(de)β-乳球蛋(dan)(dan)白層中存在(zai)(zai)機械不均一(yi)性。在(zai)(zai)我們之前的(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)究中，在(zai)(zai)用(yong)俄勒岡州綠(lv)標記的(de)(de)(de)(de)(de)人(ren)(ren)纖(xian)維蛋(dan)(dan)白原的(de)(de)(de)(de)(de)AWI處(chu)也觀察到(dao)不連續的(de)(de)(de)(de)(de)熒光層，如(ru)果(guo)蛋(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)(zhi)在(zai)(zai)類似的(de)(de)(de)(de)(de)緩沖條件(jian)下以0.01 mg/mL溶(rong)解(jie)。30早期(qi)基于(yu)2D晶格的(de)(de)(de)(de)(de)模擬預測，在(zai)(zai)低濃(nong)度(du)(du)下，可通過擴散(san)限制(zhi)聚(ju)集形(xing)成分形(xing)網絡。36 AWI處(chu)的(de)(de)(de)(de)(de)XY平面圖(tu)像（圖(tu)1E）證實了在(zai)(zai)低亞相濃(nong)度(du)(du)下AWI處(chu)存在(zai)(zai)分形(xing)組(zu)裝和AWI處(chu)的(de)(de)(de)(de)(de)異質(zhi)(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)白質(zhi)(zhi)(zhi)層。

然后(hou)，我們(men)改變溶液的(de)(de)離子(zi)強度和氧(yang)化(hua)還原狀態(tai)，并(bing)監(jian)測AWI形成(cheng)的(de)(de)蛋白(bai)(bai)質(zhi)組裝(zhuang)體。在將溶液移液到腔室后(hou)，在成(cheng)像(xiang)(xiang)之前(qian)將界(jie)(jie)(jie)面(mian)老化(hua)1小時。PBS中(zhong)0.010 mg/mL HSA-TR（離子(zi)強度=53 mM）的(de)(de)樣品在界(jie)(jie)(jie)面(mian)不同(tong)位置顯(xian)示出分形組裝(zhuang)（圖(tu)(tu)(tu)(tu)2A）和相(xiang)(xiang)(xiang)互(hu)連接的(de)(de)“瑞士(shi)干酪(lao)(lao)”結(jie)構(gou)(gou)（圖(tu)(tu)(tu)(tu)2B）。XY平面(mian)圖(tu)(tu)(tu)(tu)像(xiang)(xiang)的(de)(de)Z疊層(ceng)顯(xian)示了(le)相(xiang)(xiang)(xiang)同(tong)條件下界(jie)(jie)(jie)面(mian)蛋白(bai)(bai)質(zhi)層(ceng)的(de)(de)高分辨(bian)率3D圖(tu)(tu)(tu)(tu)像(xiang)(xiang)（圖(tu)(tu)(tu)(tu)2C）。3D圖(tu)(tu)(tu)(tu)像(xiang)(xiang)是尺寸為45.0*45.0μm2的(de)(de)多(duo)個XY平面(mian)圖(tu)(tu)(tu)(tu)像(xiang)(xiang)的(de)(de)疊加，這些圖(tu)(tu)(tu)(tu)像(xiang)(xiang)沿(yan)AWI上(shang)方和下方的(de)(de)Z軸(zhou)采集，每個方向(xiang)10μm（200*0.1μm步(bu)長）。這證實(shi)了(le)界(jie)(jie)(jie)面(mian)處的(de)(de)“瑞士(shi)奶酪(lao)(lao)”結(jie)構(gou)(gou)，并(bing)且幾(ji)乎沒(mei)有顯(xian)示來自亞相(xiang)(xiang)(xiang)的(de)(de)熒光信號(hao)。雖然沿(yan)Z軸(zhou)的(de)(de)光學分辨(bian)率是～2μm對(dui)于共焦(jiao)圖(tu)(tu)(tu)(tu)像(xiang)(xiang)，其比估計(ji)的(de)(de)蛋白(bai)(bai)質(zhi)層(ceng)厚度（30-40?）大得多(duo)，Z-stack圖(tu)(tu)(tu)(tu)像(xiang)(xiang)清楚地表(biao)明蛋白(bai)(bai)質(zhi)結(jie)構(gou)(gou)域(yu)僅在AWI處形成(cheng)，并(bing)且與在XY平面(mian)形成(cheng)的(de)(de)結(jie)構(gou)(gou)域(yu)（數百(bai)微米）相(xiang)(xiang)(xiang)比，Z方向(xiang)上(shang)的(de)(de)組裝(zhuang)受到限(xian)制。

圖(tu)2。蛋白質組裝(zhuang)的(de)(de)形態，隨離(li)(li)子強度(du)和(he)還原(yuan)劑的(de)(de)添加而變(bian)化。HSATR（0.01 mg/mL）在(zai)（A，B）PBS中的(de)(de)AWI下自組裝(zhuang)，pH值7.2，離(li)(li)子強度(du)=53 mM和(he)（C）在(zai)掃描(miao)體積為(wei)45.0*45.0*20.0μm3的(de)(de)情況(kuang)下，呈現了與圖(tu)像(xiang)(xiang)B相同的(de)(de)溶液條(tiao)件(jian)對應的(de)(de)共焦圖(tu)像(xiang)(xiang)Z疊層。（D）PBS，pH值7.2，離(li)(li)子強度(du)=530 mM。（E）30 mM DTT，pH 7.2，離(li)(li)子強度(du)=53 mM的(de)(de)PBS。比例尺：20μm。

在保(bao)持蛋白質濃度不變的(de)(de)(de)情況下，我(wo)們將緩(huan)沖液的(de)(de)(de)離(li)子強(qiang)(qiang)度增(zeng)加(jia)(jia)到(dao)(dao)(dao)(dao)530mm。老化(hua)1小(xiao)時(shi)后，我(wo)們觀察到(dao)(dao)(dao)(dao)均(jun)(jun)(jun)勻(yun)(yun)熒光(guang)層(ceng)（圖(tu)(tu)(tu)2D），表(biao)明(ming)表(biao)面過剩增(zeng)加(jia)(jia)，平衡時(shi)間(jian)(jian)縮(suo)短。在緩(huan)沖液中(zhong)含有30mmDTT（圖(tu)(tu)(tu)2E）的(de)(de)(de)樣品中(zhong)，觀察到(dao)(dao)(dao)(dao)小(xiao)的(de)(de)(de)分(fen)形結(jie)構，表(biao)明(ming)吸附蛋白質之間(jian)(jian)的(de)(de)(de)相互作用較弱(ruo)。我(wo)們還研究(jiu)(jiu)了(le)(le)HSA-TR在高離(li)子強(qiang)(qiang)度（530mm）的(de)(de)(de)PBS中(zhong)溶(rong)解時(shi)界面層(ceng)形成(cheng)的(de)(de)(de)動力學。觀察到(dao)(dao)(dao)(dao)從密集(ji)分(fen)形（圖(tu)(tu)(tu)3A）到(dao)(dao)(dao)(dao)瑞士(shi)奶(nai)酪結(jie)構（圖(tu)(tu)(tu)3B）以(yi)(yi)及最終到(dao)(dao)(dao)(dao)均(jun)(jun)(jun)勻(yun)(yun)熒光(guang)層(ceng)（圖(tu)(tu)(tu)3C）的(de)(de)(de)明(ming)顯轉(zhuan)變。在大約30分(fen)鐘內，AWI達到(dao)(dao)(dao)(dao)平衡，形成(cheng)均(jun)(jun)(jun)勻(yun)(yun)的(de)(de)(de)熒光(guang)層(ceng)。Dhar等(deng)人最近的(de)(de)(de)一項研究(jiu)(jiu)發(fa)現，隨著時(shi)間(jian)(jian)的(de)(de)(de)推(tui)移(yi)，BSA層(ceng)的(de)(de)(de)表(biao)面粘度急劇增(zeng)加(jia)(jia)，并推(tui)斷(duan)出組織(zhi)結(jie)構發(fa)生了(le)(le)變化(hua)。37我(wo)們的(de)(de)(de)研究(jiu)(jiu)直接顯示(shi)了(le)(le)從分(fen)形到(dao)(dao)(dao)(dao)均(jun)(jun)(jun)勻(yun)(yun)組織(zhi)層(ceng)的(de)(de)(de)形態轉(zhuan)變，這可以(yi)(yi)解釋觀察到(dao)(dao)(dao)(dao)的(de)(de)(de)抗(kang)剪切(qie)性增(zeng)加(jia)(jia)。

圖3。顯示異質結構域(yu)轉變為同質層的熒光(guang)圖像(xiang)。C（HSA-TR）=PBS中的0.01 mg/mL，pH值7.2，離子強(qiang)度=530 mM。（A）3、（B）8和（C）將蛋(dan)白質溶液引入試驗箱后(hou)36分(fen)鐘。標尺：50μm。

我們的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)果表(biao)明(ming)，溶液(ye)條件可(ke)以調節蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)自組(zu)裝(zhuang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結(jie)構(gou)(gou)。HSA的(de)(de)(de)(de)(de)(de)等電點約(yue)為(wei)4.7。24因此，在(zai)pH值為(wei)7.2時，HSA-TR帶(dai)負電。靜電排斥(chi)(chi)強烈影響HSA-TR在(zai)AWI處的(de)(de)(de)(de)(de)(de)聚(ju)集，導(dao)致低(di)包裝(zhuang)效率(lv)，如(ru)圖2A，B所(suo)示(shi)。分(fen)形結(jie)構(gou)(gou)和(he)瑞士干酪結(jie)構(gou)(gou)共存表(biao)明(ming)非平衡狀(zhuang)態，這(zhe)是由于(yu)蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)從(cong)(cong)亞相(xiang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)緩慢吸附(fu)(fu)受到界(jie)面上(shang)已(yi)經存在(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)帶(dai)電蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)排斥(chi)(chi)力的(de)(de)(de)(de)(de)(de)阻礙。在(zai)較高的(de)(de)(de)(de)(de)(de)離(li)子(zi)強度(du)(du)下(xia)，帶(dai)電蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)分(fen)子(zi)之(zhi)間(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)靜電斥(chi)(chi)力被更有效地屏蔽(bi)，HSA-TR吸附(fu)(fu)到界(jie)面的(de)(de)(de)(de)(de)(de)速度(du)(du)更快(kuai)，并且能夠更緊密(mi)地堆(dui)(dui)積，從(cong)(cong)而形成(cheng)更均勻的(de)(de)(de)(de)(de)(de)層(ceng)。如(ru)圖2D和(he)3C所(suo)示(shi)，AWI的(de)(de)(de)(de)(de)(de)完(wan)全覆(fu)(fu)蓋(gai)率(lv)低(di)于(yu)CB sat。在(zai)較低(di)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)離(li)子(zi)強度(du)(du)（193 mM）下(xia)，在(zai)吸附(fu)(fu)時間(jian)(jian)1 h后，測定CB sat在(zai)0.025和(he)0.050 mg/mL之(zhi)間(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)值。在(zai)較高的(de)(de)(de)(de)(de)(de)離(li)子(zi)強度(du)(du)（530mm）下(xia)，由于(yu)被吸附(fu)(fu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)和(he)來(lai)自塊體(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)之(zhi)間(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)排斥(chi)(chi)作用較小，因此塊體(ti)溶液(ye)蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)對AWI的(de)(de)(de)(de)(de)(de)吸附(fu)(fu)更快(kuai)。此外，蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)分(fen)子(zi)在(zai)界(jie)面上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)堆(dui)(dui)積效率(lv)更高，從(cong)(cong)而實現了更高的(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)覆(fu)(fu)蓋(gai)率(lv)。

據報道，吸附(fu)在(zai)AWI上的(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)質可(ke)以(yi)形(xing)(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)分(fen)(fen)子(zi)(zi)間(jian)(jian)二(er)(er)硫鍵(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)，從而穩(wen)定蛋(dan)白(bai)(bai)質網(wang)絡并(bing)增(zeng)強吸附(fu)層(ceng)的(de)(de)(de)(de)(de)彈性(xing)。38 HSA有一個反應(ying)(ying)性(xing)半胱氨酸，Cys34，可(ke)在(zai)AWI處與相鄰蛋(dan)白(bai)(bai)質形(xing)(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)二(er)(er)硫鍵(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)。此(ci)(ci)外，吸附(fu)后構象的(de)(de)(de)(de)(de)變(bian)化可(ke)能導(dao)致分(fen)(fen)子(zi)(zi)內二(er)(er)硫鍵(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)斷裂，為分(fen)(fen)子(zi)(zi)間(jian)(jian)二(er)(er)硫鍵(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)形(xing)(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)提供更多的(de)(de)(de)(de)(de)反應(ying)(ying)位點。DTT等還原劑抑制分(fen)(fen)子(zi)(zi)間(jian)(jian)二(er)(er)硫鍵(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)形(xing)(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)，因(yin)此(ci)(ci)只剩下(xia)小聚(ju)集體，這(zhe)些聚(ju)集體可(ke)能通過疏水(shui)相互作(zuo)用(yong)結(jie)合在(zai)一起。Vogler等人(ren)應(ying)(ying)用(yong)界面流(liu)變(bian)學(xue)來研究AWI處的(de)(de)(de)(de)(de)HSA，并(bing)發現吸附(fu)層(ceng)既具有粘性(xing)又具有彈性(xing)。28二(er)(er)硫鍵(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)形(xing)(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)支持彈性(xing)來自分(fen)(fen)子(zi)(zi)間(jian)(jian)相互作(zuo)用(yong)網(wang)絡的(de)(de)(de)(de)(de)假設。有趣(qu)的(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)，利用(yong)BSA進行的(de)(de)(de)(de)(de)微流(liu)變(bian)學(xue)研究發現，蛋(dan)白(bai)(bai)質膜(mo)主要是(shi)粘性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)，沒有形(xing)(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)強的(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)子(zi)(zi)間(jian)(jian)鍵(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)。37因(yin)此(ci)(ci)，AWI處蛋(dan)白(bai)(bai)質二(er)(er)硫鍵(jian)(jian)(jian)(jian)(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)用(yong)可(ke)能在(zai)不同的(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)質系(xi)統(tong)中有很大差(cha)異。

最后(hou)，將FDA批(pi)準的(de)(de)(de)表(biao)(biao)面(mian)(mian)活(huo)(huo)(huo)性劑F-127添加到HSA-TR溶(rong)液(ye)中(zhong)，以改變AWI處(chu)吸附(fu)物(wu)種(zhong)之間(jian)的(de)(de)(de)疏(shu)(shu)(shu)水(shui)(shui)相(xiang)互作用(yong)。疏(shu)(shu)(shu)水(shui)(shui)相(xiang)互作用(yong)導(dao)致蛋(dan)白質(zhi)(zhi)中(zhong)疏(shu)(shu)(shu)水(shui)(shui)單(dan)元的(de)(de)(de)組(zu)裝(zhuang)或聚(ju)集，從而降低(di)溶(rong)劑化(hua)能。39在蛋(dan)白質(zhi)(zhi)組(zu)裝(zhuang)中(zhong)，多個(ge)(ge)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)分(fen)子的(de)(de)(de)疏(shu)(shu)(shu)水(shui)(shui)斑塊傾向于(yu)聚(ju)集在一起，將水(shui)(shui)從其(qi)表(biao)(biao)面(mian)(mian)排除，從而增(zeng)加系統的(de)(de)(de)熵。40當添加更疏(shu)(shu)(shu)水(shui)(shui)的(de)(de)(de)表(biao)(biao)面(mian)(mian)活(huo)(huo)(huo)性劑時，它與蛋(dan)白質(zhi)(zhi)-蛋(dan)白質(zhi)(zhi)疏(shu)(shu)(shu)水(shui)(shui)相(xiang)互作用(yong)競爭。已知(zhi)表(biao)(biao)面(mian)(mian)活(huo)(huo)(huo)性劑在AWI處(chu)與蛋(dan)白質(zhi)(zhi)相(xiang)互作用(yong)，顯著降低(di)表(biao)(biao)面(mian)(mian)張力并改變表(biao)(biao)面(mian)(mian)層的(de)(de)(de)流變行為。41如(ru)Morris等人先(xian)前AFM研究(jiu)中(zhong)的(de)(de)(de)“造山(shan)”模型所述，表(biao)(biao)面(mian)(mian)活(huo)(huo)(huo)性劑以非均勻方式從AWI置換蛋(dan)白質(zhi)(zhi)。19然(ran)(ran)而，只有(you)BAM研究(jiu)18提供了現場測量的(de)(de)(de)直接證據，動態(tai)轉(zhuan)變的(de)(de)(de)各個(ge)(ge)方面(mian)(mian)仍然(ran)(ran)未得(de)到充(chong)分(fen)探索。

通過(guo)我們的(de)(de)(de)(de)(de)原(yuan)位(wei)熒(ying)(ying)光顯微(wei)鏡方法(fa)，我們在(zai)(zai)HSA-TR/F-127混(hun)合(he)(he)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)AWI處發現(xian)了熒(ying)(ying)光強(qiang)度(du)較強(qiang)和較弱(ruo)(ruo)的(de)(de)(de)(de)(de)區(qu)(qu)域，表(biao)(biao)明(ming)(ming)發生了相分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)。蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)在(zai)(zai)AWI處形(xing)成(cheng)粘彈(dan)性(xing)(xing)(xing)(xing)網絡(luo)，導致蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子遷移(yi)率比(bi)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)-表(biao)(biao)面(mian)(mian)活性(xing)(xing)(xing)(xing)劑混(hun)合(he)(he)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子遷移(yi)率小2個數量(liang)級。41因此，我們預計富(fu)含(han)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)區(qu)(qu)域的(de)(de)(de)(de)(de)熒(ying)(ying)光恢(hui)復(fu)(fu)速度(du)應比(bi)表(biao)(biao)面(mian)(mian)活性(xing)(xing)(xing)(xing)區(qu)(qu)域慢(man)得(de)多(duo)。為(wei)(wei)了驗證這(zhe)一假設，我們進(jin)行了FRAP實驗，用(yong)HSA-TR/F-127溶(rong)液（HSA-TR為(wei)(wei)0.10 mg/mL）和F-127溶(rong)液（HSA-TR為(wei)(wei)0.0050 mg/mL）評估界面(mian)(mian)層的(de)(de)(de)(de)(de)流動(dong)性(xing)(xing)(xing)(xing)。用(yong)近紫(zi)外激光束(shu)同時(shi)漂(piao)(piao)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)強(qiang)熒(ying)(ying)光和弱(ruo)(ruo)熒(ying)(ying)光區(qu)(qu)域的(de)(de)(de)(de)(de)兩個圓形(xing)區(qu)(qu)域20 s。在(zai)(zai)之(zhi)前和之(zhi)后拍攝圖像使(shi)用(yong)衰(shuai)減(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)543nm激光作為(wei)(wei)激發源進(jin)行漂(piao)(piao)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)。照射(she)90秒(miao)后，左(zuo)上(shang)方的(de)(de)(de)(de)(de)漂(piao)(piao)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)區(qu)(qu)變小，25分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)鐘后，強(qiang)度(du)幾乎完全恢(hui)復(fu)(fu)；然而，右下方的(de)(de)(de)(de)(de)漂(piao)(piao)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)區(qu)(qu)域并未隨時(shi)間(jian)改變形(xing)狀或強(qiang)度(du)（圖4）。因此，我們得(de)出結(jie)論，強(qiang)度(du)恢(hui)復(fu)(fu)率的(de)(de)(de)(de)(de)巨大差異表(biao)(biao)明(ming)(ming)界面(mian)(mian)上(shang)“富(fu)含(han)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)”和“富(fu)含(han)表(biao)(biao)面(mian)(mian)活性(xing)(xing)(xing)(xing)劑”區(qu)(qu)域的(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)。熒(ying)(ying)光強(qiang)度(du)較強(qiang)的(de)(de)(de)(de)(de)區(qu)(qu)域主(zhu)要由(you)HSA-TR組成(cheng)，熒(ying)(ying)光強(qiang)度(du)較弱(ruo)(ruo)的(de)(de)(de)(de)(de)區(qu)(qu)域主(zhu)要由(you)HSA-TR與F-127混(hun)合(he)(he)組成(cheng)。表(biao)(biao)面(mian)(mian)活性(xing)(xing)(xing)(xing)劑富(fu)集區(qu)(qu)的(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)被(bei)表(biao)(biao)面(mian)(mian)活性(xing)(xing)(xing)(xing)劑分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)，更容易擴散(san)，使(shi)得(de)HSA-TR的(de)(de)(de)(de)(de)橫向遷移(yi)率遠高(gao)于蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)富(fu)集區(qu)(qu)。然而，熒(ying)(ying)光恢(hui)復(fu)(fu)期間(jian)漂(piao)(piao)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)區(qu)(qu)形(xing)狀的(de)(de)(de)(de)(de)變化表(biao)(biao)明(ming)(ming)，富(fu)含(han)表(biao)(biao)面(mian)(mian)活性(xing)(xing)(xing)(xing)劑的(de)(de)(de)(de)(de)區(qu)(qu)域中的(de)(de)(de)(de)(de)質(zhi)(zhi)量(liang)傳輸不均勻。結(jie)合(he)(he)多(duo)種擴散(san)過(guo)程的(de)(de)(de)(de)(de)適當分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)析(xi)方法(fa)，FRAP實驗有可能確定AWI處蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)(bai)(bai)質(zhi)(zhi)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子擴散(san)系數的(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)布。

圖4。界面層光(guang)漂(piao)白后的(de)熒光(guang)恢復(fu)。ROI（黃色圓圈(quan)）是選定的(de)光(guang)漂(piao)白區(qu)域。ROI-1位于富含表面活性劑的(de)區(qu)域，而ROI-2位于富含HSA TR的(de)區(qu)域。初始亞相濃度為[HSA-TR]=0.10 mg/mL和[F-127]=0.0050 mg/mL。比例尺(chi)：20μm。

我(wo)們(men)(men)發現(xian)在(zai)(zai)(zai)(zai)HSA-TR/F-127混合(he)物中(zhong)(zhong)，蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)里(li)奇(qi)區(qu)表現(xian)出隨時(shi)(shi)間變化的(de)形(xing)態變化，這促使(shi)我(wo)們(men)(men)更詳細地研究這一動態現(xian)象。圖(tu)5所示(shi)(shi)的(de)結(jie)果(guo)是通(tong)過將HSA-TR（0.50 mg/mL）與(yu)(yu)F-127（0.015 mg/mL）混合(he)，聚(ju)焦在(zai)(zai)(zai)(zai)AWI上拍(pai)攝的(de)圖(tu)像(xiang)(xiang)。圖(tu)5A顯示(shi)(shi)了將溶液(ye)用移液(ye)管(guan)移入腔室后35至60分鐘(zhong)內聚(ju)焦在(zai)(zai)(zai)(zai)同一區(qu)域的(de)三幅(fu)圖(tu)像(xiang)(xiang)。可(ke)見面(mian)(mian)積為10-100μm2的(de)小(xiao)圓形(xing)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)質(zhi)島(dao)(dao)。感興趣區(qu)域（ROI，由(you)圖(tu)5中(zhong)(zhong)的(de)黃色方框表示(shi)(shi)）突出顯示(shi)(shi)了一些有趣的(de)觀(guan)察(cha)結(jie)果(guo)：在(zai)(zai)(zai)(zai)ROI-1中(zhong)(zhong)，與(yu)(yu)35分鐘(zhong)時(shi)(shi)的(de)圖(tu)像(xiang)(xiang)相比，小(xiao)的(de)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)質(zhi)島(dao)(dao)在(zai)(zai)(zai)(zai)50分鐘(zhong)時(shi)(shi)與(yu)(yu)周圍的(de)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)質(zhi)島(dao)(dao)結(jie)合(he)形(xing)成(cheng)(cheng)一個更大(da)的(de)島(dao)(dao)。在(zai)(zai)(zai)(zai)ROI-2中(zhong)(zhong)，從(cong)50分鐘(zhong)開始可(ke)以看到(dao)小(xiao)黑洞，表明F-127在(zai)(zai)(zai)(zai)這些位(wei)點取代了HSA-TR，并在(zai)(zai)(zai)(zai)富含蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)質(zhi)的(de)區(qu)域內形(xing)成(cheng)(cheng)空腔。在(zai)(zai)(zai)(zai)ROI-3中(zhong)(zhong)，可(ke)以觀(guan)察(cha)到(dao)表面(mian)(mian)活性劑富集區(qu)前沿(yan)的(de)移動。很明顯，隨著時(shi)(shi)間的(de)推移，表面(mian)(mian)活性劑富集區(qu)不斷擴大(da)。在(zai)(zai)(zai)(zai)ROI-4中(zhong)(zhong)，小(xiao)的(de)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)質(zhi)島(dao)(dao)合(he)并成(cheng)(cheng)網(wang)狀網(wang)絡。

圖(tu)5。蛋白(bai)(bai)質島(dao)隨時間的(de)(de)聚(ju)合。（A）導入后35、50和60分鐘拍攝的(de)(de)共焦熒光圖(tu)像。比例尺：20μm.（B）蛋白(bai)(bai)質島(dao)大小(xiao)分布(bu)的(de)(de)直方(fang)圖(tu)。初始亞期濃度為[HSA-TR]=0.50 mg/mL和[F-127]=0.015 mg/mL。ROI-1表(biao)示一個區(qu)(qu)域（黃(huang)色(se)框），其中(zhong)小(xiao)的(de)(de)蛋白(bai)(bai)質島(dao)與周(zhou)圍(wei)的(de)(de)蛋白(bai)(bai)質島(dao)結合形(xing)成(cheng)一個較大的(de)(de)島(dao)；ROI-2表(biao)明該區(qu)(qu)域形(xing)成(cheng)了小(xiao)黑洞；ROI-3表(biao)示在表(biao)面活性劑(ji)富集區(qu)(qu)域的(de)(de)邊(bian)界處的(de)(de)運動；ROI-4顯示了小(xiao)的(de)(de)蛋白(bai)(bai)質島(dao)合并成(cheng)網狀(zhuang)網絡的(de)(de)地方(fang)。

我們使用(yong)(yong)ImageJ分(fen)析了蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)島(dao)(dao)(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)大小(xiao)分(fen)布(bu)（圖5B）。31面(mian)(mian)(mian)積(ji)(ji)分(fen)數定義(yi)為相(xiang)同(tong)大小(xiao)的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)島(dao)(dao)(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)積(ji)(ji)除以蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)島(dao)(dao)(dao)(dao)總面(mian)(mian)(mian)積(ji)(ji)的(de)(de)(de)(de)總和。圖5B顯示(shi)了島(dao)(dao)(dao)(dao)嶼規模分(fen)布(bu)的(de)(de)(de)(de)明顯增長趨勢。蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)島(dao)(dao)(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)平均面(mian)(mian)(mian)積(ji)(ji)從(cong)(cong)24μm2（35分(fen)鐘）增加(jia)到(dao)(dao)(dao)57μm2（60分(fen)鐘）。通過(guo)使用(yong)(yong)30幀/秒的(de)(de)(de)(de)更快掃(sao)描速(su)率（支持信息(xi)中的(de)(de)(de)(de)電影S1，其中電影中的(de)(de)(de)(de)圖像顯示(shi)速(su)度(du)比(bi)實時(shi)(shi)慢10倍(bei)）也觀察到(dao)(dao)(dao)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)島(dao)(dao)(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)運(yun)動(dong)，并(bing)且觀察到(dao)(dao)(dao)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)島(dao)(dao)(dao)(dao)表(biao)(biao)現出(chu)類似(si)于單層脂質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)結構(gou)(gou)域(yu)布(bu)朗運(yun)動(dong)的(de)(de)(de)(de)運(yun)動(dong)。42重要的(de)(de)(de)(de)是，觀察到(dao)(dao)(dao)鄰近島(dao)(dao)(dao)(dao)嶼在接觸時(shi)(shi)結合(he)在一起。富(fu)含蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)結構(gou)(gou)域(yu)的(de)(de)(de)(de)存在表(biao)(biao)明蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)和表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)活性劑(ji)在動(dong)力學過(guo)程中共同(tong)吸附到(dao)(dao)(dao)界(jie)面(mian)(mian)(mian)。蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)分(fen)子之間的(de)(de)(de)(de)強(qiang)相(xiang)互作用(yong)(yong)促進了結構(gou)(gou)域(yu)的(de)(de)(de)(de)形成和結構(gou)(gou)域(yu)的(de)(de)(de)(de)合(he)并(bing)，從(cong)(cong)而阻止了表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)活性劑(ji)的(de)(de)(de)(de)置(zhi)換(huan)。然而，F-127的(de)(de)(de)(de)界(jie)面(mian)(mian)(mian)占(zhan)有率在熱力學上是有利的(de)(de)(de)(de)，其中F-127在0.015 mg/mL時(shi)(shi)的(de)(de)(de)(de)平衡表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)張(zhang)力約為40 mN/m43，而HSA在0.50 mg/mL時(shi)(shi)的(de)(de)(de)(de)平衡表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)張(zhang)力為52-60 mN/m。34因此，隨著時(shi)(shi)間的(de)(de)(de)(de)推移，蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)結構(gou)(gou)域(yu)逐漸被(bei)表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)活性劑(ji)從(cong)(cong)本體中置(zhi)換(huan)，以降低(di)表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)能。

表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)活(huo)(huo)性(xing)(xing)劑(ji)穿透蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)結(jie)(jie)構(gou)(gou)域(yu)(yu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)觀察和表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)活(huo)(huo)性(xing)(xing)劑(ji)富集區的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)擴展符合(he)(he)造山模(mo)(mo)(mo)型(xing)。該模(mo)(mo)(mo)型(xing)表(biao)(biao)明，表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)活(huo)(huo)性(xing)(xing)劑(ji)首(shou)先穿透蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)層(ceng)，形(xing)成缺陷(xian)或孔洞，從而(er)取(qu)代(dai)界(jie)面(mian)(mian)(mian)上的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)。然后，隨著表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)活(huo)(huo)性(xing)(xing)劑(ji)繼(ji)續在(zai)(zai)這些區域(yu)(yu)累積，表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)活(huo)(huo)性(xing)(xing)劑(ji)區域(yu)(yu)擴張，蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)層(ceng)被(bei)迫彎曲(qu)并延伸(shen)到亞相(xiang)，直(zhi)到蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)層(ceng)最終坍塌。1,19在(zai)(zai)肺表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)活(huo)(huo)性(xing)(xing)物(wu)質(zhi)(zhi)/聚(ju)(ju)乙二(er)醇/白(bai)(bai)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)混合(he)(he)物(wu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)顯示(shi)了(le)不同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)置(zhi)換機制，這表(biao)(biao)明競爭吸附過(guo)程(cheng)可能依賴于系(xi)統。在(zai)(zai)表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)張力(li)和表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)流變學研究(jiu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，44個理論模(mo)(mo)(mo)型(xing)已被(bei)開發用于解釋蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)/表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)活(huo)(huo)性(xing)(xing)劑(ji)混合(he)(he)溶(rong)液(ye)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)吸附動力(li)學和平衡狀態。41作為對這些研究(jiu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)補(bu)充，我(wo)們的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)工作提(ti)供了(le)關于蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)和表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)活(huo)(huo)性(xing)(xing)劑(ji)在(zai)(zai)界(jie)面(mian)(mian)(mian)上的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)位置(zhi)以(yi)及組裝(zhuang)結(jie)(jie)構(gou)(gou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)更(geng)詳細信息(xi)。在(zai)(zai)我(wo)們的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)研究(jiu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)觀察到的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)聚(ju)(ju)結(jie)(jie)現(xian)象表(biao)(biao)明，相(xiang)鄰的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)結(jie)(jie)構(gou)(gou)域(yu)(yu)有重(zhong)組連接網絡的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)趨(qu)勢，而(er)其他蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)正被(bei)表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)活(huo)(huo)性(xing)(xing)劑(ji)取(qu)代(dai)，因(yin)此(ci)突出了(le)HSA-TR/F-127混合(he)(he)物(wu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)結(jie)(jie)構(gou)(gou)域(yu)(yu)聚(ju)(ju)結(jie)(jie)和表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)活(huo)(huo)性(xing)(xing)劑(ji)取(qu)代(dai)蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)兩(liang)個競爭過(guo)程(cheng)。

應用熒光顯微鏡研究了蛋白質在氣-水界面的組裝——摘要、介紹

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