3、結果和討論

在(zai)(zai)表征脂(zhi)(zhi)肪酶(mei)(mei)(mei)(mei)對(dui)某些天然(ran)脂(zhi)(zhi)質的(de)(de)(de)底(di)物(wu)特(te)(te)異性(xing)(xing)時，最常用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)是基于乳(ru)化反應體系(xi)，使用(yong)(yong)(yong)pH-stat法(fa)。雖然(ran)通(tong)過(guo)這種(zhong)方(fang)(fang)法(fa)，我們可以(yi)得(de)到(dao)酶(mei)(mei)(mei)(mei)對(dui)某些天然(ran)脂(zhi)(zhi)質底(di)物(wu)的(de)(de)(de)酶(mei)(mei)(mei)(mei)活(huo)(huo)性(xing)(xing)，并(bing)且可以(yi)滿足酶(mei)(mei)(mei)(mei)對(dui)界面(mian)的(de)(de)(de)需求，但反應對(dui)底(di)物(wu)和(he)(he)酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)(de)(de)需求是豐富的(de)(de)(de)，當底(di)物(wu)或(huo)酶(mei)(mei)(mei)(mei)價格昂貴(gui)或(huo)不易獲得(de)時，不適合評(ping)估酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)(de)(de)活(huo)(huo)性(xing)(xing)。這種(zhong)方(fang)(fang)法(fa)的(de)(de)(de)另(ling)一個限(xian)制(zhi)是，對(dui)于乳(ru)化體系(xi)，不可能控制(zhi)“界面(mian)質量”，也(ye)不可能在(zai)(zai)恒定(ding)表面(mian)壓力下跟蹤脂(zhi)(zhi)肪酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)(de)(de)動(dong)力學行(xing)為(wei)[10]。據報道，表面(mian)壓力可以(yi)通(tong)過(guo)橫(heng)向(xiang)密度的(de)(de)(de)變(bian)化以(yi)及脂(zhi)(zhi)質組織和(he)(he)結(jie)構(gou)的(de)(de)(de)變(bian)化影(ying)響(xiang)(xiang)脂(zhi)(zhi)質結(jie)構(gou)域(yu)的(de)(de)(de)形成，最終影(ying)響(xiang)(xiang)脂(zhi)(zhi)肪酶(mei)(mei)(mei)(mei)的(de)(de)(de)立體選擇性(xing)(xing)、區域(yu)選擇性(xing)(xing)和(he)(he)底(di)物(wu)選擇性(xing)(xing)[17-19]。因此，傳(chuan)統的(de)(de)(de)pH-stat法(fa)對(dui)活(huo)(huo)性(xing)(xing)檢測仍有一定(ding)的(de)(de)(de)局(ju)限(xian)性(xing)(xing)。此外，由于不同天然(ran)磷脂(zhi)(zhi)標(biao)準品的(de)(de)(de)價格非常昂貴(gui)，因此沒有采(cai)用(yong)(yong)(yong)常規(gui)的(de)(de)(de)活(huo)(huo)性(xing)(xing)測試方(fang)(fang)法(fa)。在(zai)(zai)此，使用(yong)(yong)(yong)小(xiao)體積(ji)的(de)(de)(de)酶(mei)(mei)(mei)(mei)和(he)(he)底(di)物(wu)進行(xing)單(dan)層(ceng)技(ji)術，并(bing)在(zai)(zai)反應過(guo)程中(zhong)精確控制(zhi)表面(mian)壓力，選擇單(dan)層(ceng)技(ji)術來研究底(di)物(wu)特(te)(te)異性(xing)(xing)。

圖1顯示(shi)了空(kong)氣-水界面上不(bu)同磷脂(zhi)單(dan)(dan)(dan)層的(de)(de)(de)(de)(de)(de)π-A曲線(xian)形狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)。這(zhe)里(li)測試的(de)(de)(de)(de)(de)(de)所(suo)有磷脂(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)π-A曲線(xian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)形狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)都(dou)是在所(suo)有顯示(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)面壓(ya)力(li)下單(dan)(dan)(dan)一液體膨(peng)脹(zhang)（LE）和液體冷凝（LC）狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)態(tai)(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)特征。在壓(ya)縮(suo)時，單(dan)(dan)(dan)層經歷了一個(ge)轉變，這(zhe)被視(shi)為從(cong)LE（低于10 mN/m）到(dao)LC狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)態(tai)(tai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)轉變。在高分(fen)子區域，由于分(fen)子堆(dui)積的(de)(de)(de)(de)(de)(de)增加，表(biao)面壓(ya)力(li)升高，但不(bu)改變單(dan)(dan)(dan)層膜(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)彈性(xing)。最后(hou)，單(dan)(dan)(dan)分(fen)子膜(mo)達(da)到(dao)了一種(zhong)更為濃(nong)縮(suo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)態(tai)(tai)，但在π-a等(deng)溫線(xian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)形狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)中沒有明顯的(de)(de)(de)(de)(de)(de)崩塌(ta)點。對于這(zhe)里(li)測試的(de)(de)(de)(de)(de)(de)磷脂(zhi)，它們都(dou)可以形成穩定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)膜(mo)，并表(biao)現出良好的(de)(de)(de)(de)(de)(de)壓(ya)縮(suo)性(xing)能(neng)，DOPC的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)面壓(ya)力(li)甚至達(da)到(dao)57 mN/m。

在(zai)本研究中，為了獲(huo)得商業酶對(dui)各種天然磷(lin)脂(zhi)的(de)(de)底(di)物選擇性(xing)信(xin)息，并為實際應用提供經(jing)濟(ji)指(zhi)導，商業酶直接使(shi)用，無需進一步加(jia)工。此外，子(zi)階段(duan)使(shi)用的(de)(de)緩沖液pH值調整為5.0，與(yu)油脫膠工業中使(shi)用的(de)(de)實際反應條件一致。基(ji)于(yu)上述π-A曲線，我們最終(zhong)選擇在(zai)10 mN/m到30 mN/m的(de)(de)表面壓差下(xia)測試超乳糖酸酶對(dui)不(bu)同磷(lin)脂(zhi)的(de)(de)活性(xing)。

圖(tu)2示出了(le)使用各種(zhong)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)作為(wei)水(shui)解(jie)(jie)(jie)底物(wu)(wu)獲得(de)的(de)(de)(de)(de)詳(xiang)細活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)-表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)力(li)曲(qu)(qu)線(xian)。可(ke)(ke)以(yi)看出，酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)水(shui)解(jie)(jie)(jie)活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)高度依賴于(yu)(yu)表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)力(li)。然(ran)而，每(mei)種(zhong)底物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)曲(qu)(qu)線(xian)不同。發現基(ji)板PE、PS和(he)CL的(de)(de)(de)(de)鐘(zhong)形曲(qu)(qu)線(xian)具有(you)特征性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)最佳表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)力(li)值（圖(tu)2B、D、E）。在(zai)(zai)低于(yu)(yu)15 mN/m的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)力(li)下(xia)，未(wei)檢測到(dao)(dao)基(ji)本(ben)酶(mei)(mei)活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)。水(shui)解(jie)(jie)(jie)活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)隨(sui)表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)力(li)的(de)(de)(de)(de)增(zeng)加(jia)(jia)而增(zeng)加(jia)(jia)。在(zai)(zai)25 mN/m的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)力(li)下(xia)，觀察(cha)到(dao)(dao)PE、PS和(he)CL的(de)(de)(de)(de)最大活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)。然(ran)而，當表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)力(li)高于(yu)(yu)25 mN/m時，所(suo)有(you)這(zhe)些磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)的(de)(de)(de)(de)水(shui)解(jie)(jie)(jie)活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)降低。與所(suo)有(you)測試(shi)(shi)的(de)(de)(de)(de)底物(wu)(wu)相比，在(zai)(zai)25 mN/m的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)力(li)下(xia)，PE的(de)(de)(de)(de)水(shui)解(jie)(jie)(jie)率最高，水(shui)解(jie)(jie)(jie)活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)達(da)到(dao)(dao)5272.31×10-11摩(mo)爾(er)。cm-2。最小-1。mL-1。對(dui)于(yu)(yu)PI，在(zai)(zai)15 mN/m以(yi)下(xia)也沒(mei)有(you)觀察(cha)到(dao)(dao)水(shui)解(jie)(jie)(jie)速率，但(dan)是，沒(mei)有(you)觀察(cha)到(dao)(dao)鐘(zhong)形曲(qu)(qu)線(xian)，并(bing)且隨(sui)著表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)力(li)從(cong)(cong)(cong)15 mN/m增(zeng)加(jia)(jia)到(dao)(dao)30 mN/m，活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)增(zeng)強(qiang)（圖(tu)2C）。對(dui)于(yu)(yu)PC，從(cong)(cong)(cong)10 mN/m到(dao)(dao)25 mN/m觀察(cha)到(dao)(dao)鐘(zhong)形曲(qu)(qu)線(xian)，但(dan)在(zai)(zai)30 mN/m的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)力(li)下(xia)，活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)進一步增(zeng)加(jia)(jia)。隨(sui)著表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)力(li)從(cong)(cong)(cong)25 mN/m增(zeng)加(jia)(jia)到(dao)(dao)30 mN/m，表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)輪廓(kuo)上的(de)(de)(de)(de)單層構(gou)象(xiang)可(ke)(ke)能發生了(le)變化(hua)，導致活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)增(zeng)加(jia)(jia)。在(zai)(zai)本(ben)實驗中(zhong)，在(zai)(zai)測試(shi)(shi)的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)力(li)范圍內，SM沒(mei)有(you)活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)。從(cong)(cong)(cong)π-A曲(qu)(qu)線(xian)可(ke)(ke)以(yi)看出，在(zai)(zai)25 mN/m的(de)(de)(de)(de)表(biao)(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)壓(ya)(ya)力(li)下(xia)測試(shi)(shi)的(de)(de)(de)(de)所(suo)有(you)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)都處于(yu)(yu)液態(tai)冷凝狀態(tai)，沒(mei)有(you)達(da)到(dao)(dao)各自的(de)(de)(de)(de)坍塌(ta)壓(ya)(ya)力(li)。在(zai)(zai)這(zhe)種(zhong)情況下(xia)，超卵(luan)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)酶(mei)(mei)對(dui)不同單分子磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)膜的(de)(de)(de)(de)偏好順序(xu)為(wei)PE>CL>PS>PI>PC。在(zai)(zai)這(zhe)些條(tiao)件下(xia)，SM沒(mei)有(you)活(huo)(huo)(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)。Lecitase Ultra選擇性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)詳(xiang)細機制(zhi)仍需闡明(ming)。

4、結論

利(li)(li)用單層技術，成功地表(biao)征了(le)超(chao)乳糖酸(suan)酶對(dui)各(ge)種天然磷(lin)脂(zhi)的底(di)物(wu)特異性。在(zai)(zai)本研究(jiu)(jiu)中，除SM外，Lecitase Ultra對(dui)各(ge)種磷(lin)脂(zhi)表(biao)現出廣泛的選擇(ze)性。在(zai)(zai)所有(you)(you)測試的磷(lin)脂(zhi)中，觀察到對(dui)兩(liang)性磷(lin)脂(zhi)PE的高度偏好(hao)。目前對(dui)Lecitase Ultra的研究(jiu)(jiu)為(wei)其(qi)底(di)物(wu)選擇(ze)性提(ti)供了(le)第一(yi)手信息，并為(wei)在(zai)(zai)原(yuan)油脫膠或磷(lin)脂(zhi)轉化過程中有(you)(you)效(xiao)利(li)(li)用該酶提(ti)供了(le)有(you)(you)利(li)(li)信息。

這項工作是由中(zhong)(zhong)國(guo)國(guo)家自然科(ke)(ke)學基(ji)金（31471690,31401627）、中(zhong)(zhong)國(guo)廣東省(sheng)科(ke)(ke)技計(ji)劃（2013B0510000 09）和(he)中(zhong)(zhong)國(guo)廣州(zhou)珀(po)爾里(li)弗科(ke)(ke)技計(ji)劃（201610010074）提(ti)供的。作者聲明(ming)沒(mei)有利益沖突(tu)。

人物傳說

圖1不同磷脂的表面壓力(li)-面積等溫(wen)線。

圖2使用不同磷(lin)脂(zhi)的(de)卵(luan)磷(lin)脂(zhi)酶(mei)超水解活性隨表面壓(ya)力的(de)變化。在室溫下(xia)，在零(ling)級槽中進行分析。緩沖液：50毫(hao)米(mi)檸檬酸緩沖液（pH值5.0）。活性表示為單位(wei)時間(jian)、單位(wei)反應室面積(ji)和“零(ling)級”槽中每(mei)毫(hao)升酶(mei)水解的(de)底(di)物摩爾數(shu)（摩爾數(shu)cm-2.min-1.mL-1）。