2. 實驗部分

2.1. 材料

純(chun)重組人(ren)胰(yi)島(dao)(dao)素、甲(jia)醇、氯(lv)仿(fang)和鹽酸從MP Biomedical，LLC（Solon，OH）獲得。 重組人(ren)胰(yi)島(dao)(dao)素（Catalog#199744，99.3%分析）已在大腸桿菌(jun)表達系(xi)統中產生，并使(shi)用(yong)親和純(chun)化(hua)進行純(chun)化(hua)。 所(suo)有(you)化(hua)學品均為試劑級，使(shi)用(yong)時無需進一步純(chun)化(hua)。 用(yong)于子階段制備(bei)的水(shui)來自(zi)Modulab 2020水(shui)凈化(hua)系(xi)統（德克薩斯州(zhou)圣(sheng)安東尼奧大陸水(shui)系(xi)統公(gong)司）。 純(chun)化(hua)水(shui)的表面張力為72.6 mN·m ? 1在20.0±0.5°C，電(dian)阻率(lv)為18 MΩ·cm，pH值為5.6時。

2.2. 方法

FITC人(ren)胰島(dao)素(su)(su)結合程(cheng)序。 通(tong)過FITC-HI的表觀熒(ying)(ying)(ying)光(guang)檢測HI-Langmuir單(dan)層的形貌。 由于胰島(dao)素(su)(su)是(shi)非熒(ying)(ying)(ying)光(guang)的，所(suo)以必須附加一個(ge)熒(ying)(ying)(ying)光(guang)團才能使用(yong)熒(ying)(ying)(ying)光(guang)顯(xian)微鏡(jing)。 常用(yong)的蛋白質探(tan)針是(shi)異硫氰酸(suan)熒(ying)(ying)(ying)光(guang)素(su)(su)（FITC）。

FITC共軛(e)HI的(de)(de)(de)(de)制(zhi)備方法如下(xia)。 在PBS溶(rong)液中分(fen)(fen)(fen)別制(zhi)備FITC（1 mg/mL）和(he)HI（0.3 mg/mL）溶(rong)液。 用鋁箔覆(fu)蓋FITC溶(rong)液和(he)任(ren)何含有FITC的(de)(de)(de)(de)溶(rong)液，以防止(zhi)熒(ying)(ying)光(guang)探(tan)針的(de)(de)(de)(de)光(guang)降(jiang)解(jie)。 將(jiang)(jiang)FITC溶(rong)液逐滴加入胰(yi)島素(su)(su)溶(rong)液中并攪(jiao)拌(ban)1小時。 這兩種溶(rong)液在FITC與胰(yi)島素(su)(su)的(de)(de)(de)(de)摩(mo)爾比為(wei)0.5:1至4:1的(de)(de)(de)(de)范圍內相互混合。 攪(jiao)拌(ban)后，溶(rong)液通過G-25 Sephadex柱（球狀蛋(dan)白范圍：1×103至5×103 Da）按以下(xia)順序按重(zhong)(zhong)量分(fen)(fen)(fen)離：FITC-HI、HI和(he)FITC。 當流(liu)(liu)經葡聚(ju)糖凝(ning)膠柱的(de)(de)(de)(de)其中一種組分(fen)(fen)(fen)的(de)(de)(de)(de)質量高于(yu)(yu)該(gai)范圍時，這些組分(fen)(fen)(fen)將(jiang)(jiang)首(shou)先流(liu)(liu)出(chu)。 G-25葡聚(ju)糖凝(ning)膠的(de)(de)(de)(de)最(zui)大范圍為(wei)5000da； 然(ran)而，HI的(de)(de)(de)(de)摩(mo)爾質量為(wei)5870 g mol ? 1. 三個組成部(bu)分(fen)(fen)(fen)中有兩個高于(yu)(yu)5000 Da，即HI-FITC和(he)HI。 因此，最(zui)重(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)組分(fen)(fen)(fen)HI-FITC將(jiang)(jiang)首(shou)先流(liu)(liu)出(chu)色(se)譜柱，然(ran)后流(liu)(liu)出(chu)HI。 最(zui)輕的(de)(de)(de)(de)成分(fen)(fen)(fen)是(shi)FITC和(he)FITC碎(sui)片，它們保留在柱的(de)(de)(de)(de)頂部(bu)，如柱頂部(bu)的(de)(de)(de)(de)亮綠(lv)色(se)發光(guang)所示。 柱上的(de)(de)(de)(de)紫(zi)外光(guang)顯示三個不(bu)同區(qu)域：柱底部(bu)附近的(de)(de)(de)(de)熒(ying)(ying)光(guang)綠(lv)色(se)區(qu)域，對應(ying)(ying)于(yu)(yu)FITC-HI，其上方的(de)(de)(de)(de)非熒(ying)(ying)光(guang)部(bu)分(fen)(fen)(fen)對應(ying)(ying)于(yu)(yu)未共軛(e)于(yu)(yu)FITC的(de)(de)(de)(de)HI，以及柱頂部(bu)的(de)(de)(de)(de)熒(ying)(ying)光(guang)黃色(se)區(qu)域，對應(ying)(ying)于(yu)(yu)未共軛(e)于(yu)(yu)HI的(de)(de)(de)(de)FITC。 使用PBS緩沖(chong)液運行色(se)譜柱，收集體積為(wei)1mL的(de)(de)(de)(de)等分(fen)(fen)(fen)試樣(yang)。

熒光光譜法(fa)用(yong)(yong)于選擇含有(you)FITC-HI的(de)小份樣品。 FITC探針在494nm激(ji)發時顯(xian)示出517nm的(de)發射。 人們注意到，當探針與HI共軛時，FITC發射的(de)強度增(zeng)加。 吸收光譜法(fa)用(yong)(yong)于確定HI與FITC的(de)比(bi)率，該(gai)比(bi)率由下(xia)式計算得出。21

其中MolWtHI=5870 g mol ? 1和(he)ε280，HI和(he)ε495，FITC分(fen)(fen)(fen)別為17335和(he)90000。 A495和(he)A280分(fen)(fen)(fen)別是共軛(e)物(wu)和(he)HI在(zai)494和(he)280 nm處的吸光度。 考慮到FITC在(zai)280 nm處的吸光度，校正系(xi)數為0.35×A495。 制備(bei)了各種(zhong)共軛(e)物(wu)（FITC x-HI），x代表每(mei)HI結合的FITC分(fen)(fen)(fen)子的平均數量。 一個(ge)已(yi)經準備(bei)好了1個(ge) ? 10個(ge)FITC分(fen)(fen)(fen)子與HI分(fen)(fen)(fen)子相連，但具有1個(ge)FITC分(fen)(fen)(fen)子的HI共軛(e)物(wu)主(zhu)要用于表觀熒光顯微鏡實驗。

朗繆(mou)爾(er)單(dan)(dan)層制備(bei)。 Langmuir單(dan)(dan)層實驗(yan)中(zhong)使(shi)用(yong)的(de)HI溶液(ye)(ye)濃度為(wei)0.30 mg/mL，通過將HI粉末(mo)溶解在鹽(yan)酸水(shui)溶液(ye)(ye)（pH 2）中(zhong)制備(bei)。 對于作為(wei)朗繆(mou)爾(er)單(dan)(dan)層進行(xing)的(de)所有實驗(yan)，亞相(xiang)（純水(shui)）的(de)pH值(zhi)為(wei)5.6。 Kibron槽和(he)KSV槽的(de)鋪(pu)展(zhan)液(ye)(ye)體積(ji)(ji)分別為(wei)80和(he)40μL。 HI溶液(ye)(ye)在空(kong)氣(qi)中(zhong)擴(kuo)散 ? 水(shui)界(jie)面，使(shi)用(yong)100μL注(zhu)射器（Hamilton Co.，Reno，Nevada），在亞相(xiang)表面均勻沉(chen)積(ji)(ji)小液(ye)(ye)滴，然(ran)后(hou)等待15分鐘，以使(shi)Langmuir單(dan)(dan)層達到平衡。 壓(ya)縮(suo)率(lv)設定(ding)為(wei)10mm·min ? 1. 所有等溫線(xian)和(he)原位紫外光譜 ? 在溫度（20.0±0.5℃）和(he)濕(shi)度（50±1%）保持恒定(ding)的(de)潔凈室(shi)（1000級）中(zhong)進行(xing)可見(jian)光、熒光和(he)輻照光譜測量。

表(biao)面(mian)(mian)化學和光譜學方法。 使用面(mian)(mian)積(ji)為5.9 cm×21.1 cm的Kibronμ-槽(cao)(cao)（Kibron Inc.，芬蘭赫爾辛基）測(ce)量(liang)表(biao)面(mian)(mian)壓力 ? 面(mian)(mian)積(ji)（π） ? A） 等溫(wen)線(xian) ? 減(jian)壓周期和穩定性研(yan)究(jiu)。 表(biao)面(mian)(mian)電位 ? 面(mian)(mian)積(ji)（ΔV ? A） 使用由電容(rong)式系統組成的開爾文(wen)探針在Kibron槽(cao)(cao)上獲得等溫(wen)線(xian)。 振動板設置在朗繆爾單層(ceng)表(biao)面(mian)(mian)上方約1 mm處，鍍金(jin)槽(cao)(cao)底座(zuo)用作對電極。

空氣(qi)中的(de)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)(pu)測量(liang) ? 使用(yong)(yong)(yong)HP 8452 A型(xing)紫外分光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)度(du)(du)計獲得水界(jie)面(mian) ? vis和(he)Fluorog-3熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)分光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)度(du)(du)計（Horiba Scientific，愛迪生，新澤西(xi)州）用(yong)(yong)(yong)于熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)。 HI-Langmuir單(dan)(dan)層(ceng)(ceng)膜(mo)在空氣(qi)中的(de)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)(pu) ? 使用(yong)(yong)(yong)面(mian)積為0.25 cm2的(de)分叉(cha)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)纖(xian)測量(liang)水界(jie)面(mian)，并(bing)將其放置在亞(ya)相表面(mian)上(shang)方(fang)1 mm處。 激發光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)通(tong)過(guo)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)纖(xian)從(cong)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)源傳(chuan)輸到朗繆爾單(dan)(dan)層(ceng)(ceng)膜(mo)，朗繆爾單(dan)(dan)層(ceng)(ceng)膜(mo)的(de)發射光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)通(tong)過(guo)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)纖(xian)傳(chuan)回檢測器(qi)。 紫外線(xian) ? 在Perkin Elmer Lambda 900 UV/vis/NIR光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)(pu)儀(yi)（Norwalk，CT）和(he)Fluorog-3熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)(pu)儀(yi)（與用(yong)(yong)(yong)于Langmuir單(dan)(dan)層(ceng)(ceng)的(de)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)(pu)儀(yi)相同）上(shang)分別使用(yong)(yong)(yong)1 cm光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)程長度(du)(du)的(de)石英反應杯記錄水溶液的(de)可見吸(xi)收光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)(pu)和(he)熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)(pu)。

表(biao)觀(guan)熒(ying)光(guang)顯(xian)微鏡(jing)用(yong)于(yu)觀(guan)察Langmuir單層（如有）中(zhong)區域的(de)形成。 顯(xian)微鏡(jing)需要在(zai)樣品臺頂部放置朗繆爾槽(cao)(cao)。 石英窗允(yun)許激(ji)發(fa)光(guang)穿透(tou)亞相(xiang)(xiang)，以(yi)便在(zai)空氣中(zhong)激(ji)發(fa)熒(ying)光(guang)團 ? 水界面。 實(shi)驗裝置使(shi)用(yong)Kibronμ-槽(cao)(cao)（Kibron Inc.，芬蘭赫(he)爾辛(xin)基）和熒(ying)光(guang)顯(xian)微鏡(jing)（Olympus IX-FLA）相(xiang)(xiang)結合(he)。 可用(yong)于(yu)鋪展(zhan)溶液的(de)面積為(wei)5.9 cm×21.1 cm。 該熒(ying)光(guang)圖像由熱電冷卻光(guang)電Magnafire CCD相(xiang)(xiang)機拍攝。

布(bu)魯斯特角顯(xian)微鏡（BAM）用(yong)于觀(guan)察朗繆爾單層的形貌。 使(shi)用(yong)IElli-2000成像橢偏儀在關閉補償器和(he)BAM2plus軟(ruan)件的情況(kuang)下進行測(ce)量。 IElli2000系統的標準激光器是倍頻Nd:YAG激光器（50 mW輸出(chu)），使(shi)用(yong)532 nm線。

 使用JASCO J-810分光(guang)(guang)旋光(guang)(guang)儀獲得圓二色性(xing)（CD）光(guang)(guang)譜。 在25°C下，使用2.0 mm光(guang)(guang)程長度的石英電池，在195和250 nm之間記錄(lu)光(guang)(guang)譜。

水(shui)(shui)溶液(ye)(ye)的(de)(de)紅(hong)(hong)外(wai)光(guang)譜(pu)是使(shi)用衰減總(zong)反(fan)射(she)率(lv)獲(huo)得的(de)(de)。 使(shi)用生(sheng)物(wu)ATR輔助裝置，將水(shui)(shui)樣沉積(ji)在ATR晶體表面(mian)，很容(rong)易獲(huo)得紅(hong)(hong)外(wai)光(guang)譜(pu)。 靜態模(mo)式只(zhi)需要15分鐘 ? 20μL水(shui)(shui)溶液(ye)(ye)； 但是，水(shui)(shui)溶液(ye)(ye)的(de)(de)濃度應大于0.5 mg/mL，以確保與ATR晶體適當接觸。 水(shui)(shui)銀 ? 鎘 ? 碲(di)化(hua)物(wu)（MCT）探測(ce)器(qi)（Kolmar Technologies）的(de)(de)掃(sao)描速(su)度為5 kHz。 背景光(guang)譜(pu)為純水(shui)(shui)。 將生(sheng)物(wu)ATR細胞(bao)II置于Bruker Optics Equinox55 FTIR的(de)(de)細胞(bao)室(shi)中。

紅(hong)外(wai)反射(she) ? 使用(yong)(yong)EQUINOX-55傅里(li)葉變換紅(hong)外(wai)（FTIR）光(guang)(guang)(guang)譜(pu)儀（Bruker Optics，Billerica，MA）對(dui)Langmuir單(dan)層(ceng)進行吸收光(guang)(guang)(guang)譜(pu)（IRRAS）測(ce)(ce)量，該光(guang)(guang)(guang)譜(pu)儀配備適用(yong)(yong)于空氣的(de)XA-511外(wai)部反射(she)附件 ? 水界面實(shi)驗。 紅(hong)外(wai)光(guang)(guang)(guang)束聚焦在空中 ? Kibronμ-槽(cao)的(de)水界面。 反射(she)的(de)紅(hong)外(wai)光(guang)(guang)(guang)束進入了(le)由(you)液氮冷卻的(de)HgCdTe（MCT）探測(ce)(ce)器。 獲(huo)得的(de)光(guang)(guang)(guang)譜(pu)分辨率(lv)為8 cm ? 1通過對(dui)1200個(ge)p極化掃描(miao)(miao)和(he)800個(ge)s極化掃描(miao)(miao)的(de)疊加。

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學和光譜學性質——摘要、介紹

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學和光譜學性質——實驗部分

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學和光譜學性質——結果和討論

人胰島素的朗繆爾單分子層膜的表面化學和光譜學性質——結論、致謝！