摘要

研究了(le)(le)兩(liang)種抗(kang)菌(jun)肽(tai)(tai)magainin 2和(he)(he)indolicidin與(yu)三種不同模型生物膜(mo)的(de)(de)(de)(de)相(xiang)互作(zuo)用，即單(dan)層膜(mo)、大(da)單(dan)層囊(nang)(nang)泡(pao)(pao)（luv）和(he)(he)巨(ju)(ju)大(da)脂(zhi)(zhi)質(zhi)體。當(dang)1-硬(ying)脂(zhi)(zhi)酰(xian)-2-油(you)酰(xian)-sn-甘油(you)-3-磷酸(suan)(suan)膽堿(jian)（SOPC）膜(mo)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)酸(suan)(suan)性磷脂(zhi)(zhi)1-棕(zong)櫚酰(xian)-2-油(you)酰(xian)-sn-甘油(you)-3-磷酸(suan)(suan)甘油(you)（POPG）的(de)(de)(de)(de)含(han)量增(zeng)加時，兩(liang)種肽(tai)(tai)插入脂(zhi)(zhi)質(zhi)單(dan)層的(de)(de)(de)(de)能力逐漸(jian)增(zeng)強(qiang)。吲哚(duo)青霉素(su)和(he)(he)馬(ma)蓋寧2也滲透到(dao)(dao)含(han)有膽固(gu)醇的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)單(dan)層中(zhong)（摩爾分(fen)數，X=0.1）。通過含(han)芘脂(zhi)(zhi)肪酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)(de)磷脂(zhi)(zhi)衍生物1-棕(zong)櫚酰(xian)-2-[10-（芘-1-基(ji)）癸酰(xian)基(ji)]-sn-甘油(you)-3-磷酸(suan)(suan)-rac-甘油(you)（PPDPG）的(de)(de)(de)(de)準分(fen)子/單(dan)體熒(ying)光比Ie/Im的(de)(de)(de)(de)降低，揭示(shi)了(le)(le)magainin 2的(de)(de)(de)(de)膜(mo)結合減弱了(le)(le)含(han)POPG的(de)(de)(de)(de)LUV中(zhong)的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)側向(xiang)擴(kuo)散。同樣，觀(guan)察到(dao)(dao)含(han)有二苯基(ji)己三烯(xi)（DPH）的(de)(de)(de)(de)膜(mo)的(de)(de)(de)(de)穩態(tai)熒(ying)光各向(xiang)異性增(zeng)加，揭示(shi)了(le)(le)magainin 2增(zeng)加酰(xian)基(ji)鏈順(shun)序并誘(you)導(dao)酸(suan)(suan)性磷脂(zhi)(zhi)分(fen)離。吲哚(duo)西丁(ding)也有類(lei)似(si)的(de)(de)(de)(de)作(zuo)用。用光學(xue)顯(xian)微鏡觀(guan)察了(le)(le)magainin2和(he)(he)吲哚(duo)青霉素(su)對(dui)磷脂(zhi)(zhi)膜(mo)的(de)(de)(de)(de)拓(tuo)撲效應(ying)。Magainin 2對(dui)SOPC或SOPC:膽固(gu)醇（X=0.1）巨(ju)(ju)型脂(zhi)(zhi)質(zhi)體基(ji)本(ben)沒有影響。然而，當(dang)酸(suan)(suan)性磷脂(zhi)(zhi)（XPG=0.1）包含(han)在巨(ju)(ju)大(da)囊(nang)(nang)泡(pao)(pao)中(zhong)時，觀(guan)察到(dao)(dao)有效的(de)(de)(de)(de)囊(nang)(nang)泡(pao)(pao)形成(cheng)。吲哚(duo)西丁(ding)只引起巨(ju)(ju)大(da)SOPC囊(nang)(nang)泡(pao)(pao)的(de)(de)(de)(de)輕微收縮，而當(dang)巨(ju)(ju)大(da)脂(zhi)(zhi)質(zhi)體含(han)有POPG（XPG=0.1）時，觀(guan)察到(dao)(dao)內吞囊(nang)(nang)泡(pao)(pao)的(de)(de)(de)(de)形成(cheng)。有趣的(de)(de)(de)(de)是，對(dui)于吲哚(duo)肽(tai)(tai)，由SOPC/膽固(gu)醇（Xchol=0.1）組成(cheng)的(de)(de)(de)(de)巨(ju)(ju)大(da)囊(nang)(nang)泡(pao)(pao)也可觀(guan)察到(dao)(dao)囊(nang)(nang)泡(pao)(pao)形成(cheng)。討論了(le)(le)這兩(liang)種多肽(tai)(tai)誘(you)導(dao)細胞膜(mo)轉化(hua)的(de)(de)(de)(de)可能機制(zhi)。

介紹

在過去(qu)十年中(zhong)(zhong)，在動植物(wu)(wu)和(he)(he)(he)細菌(jun)(jun)中(zhong)(zhong)發(fa)現了(le)越(yue)來越(yue)多的(de)抗菌(jun)(jun)肽(tai)，如天(tian)蠶素、防御素、馬(ma)蓋(gai)寧、蜂毒(du)素、吲哚青霉素和(he)(he)(he)阿(a)拉米霉素。這些(xie)肽(tai)在脊椎動物(wu)(wu)和(he)(he)(he)無脊椎動物(wu)(wu)中(zhong)(zhong)用(yong)(yong)(yong)于進(jin)攻和(he)(he)(he)防御目的(de)（Sansom，1991；Saberwal和(he)(he)(he)Nagaraj，1994；Matsuzaki，1998），通過與(yu)脂質(zhi)相(xiang)(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)(yong)(yong)，以某種方式干(gan)擾靶細胞膜的(de)屏(ping)障特(te)性(xing)(xing)(xing)（Bechinger，1997；Matsuzaki，1998，1999；Oren和(he)(he)(he)Shai，1998；Shai，1999；Sitaram和(he)(he)(he)Nagaraj，1999）。作(zuo)為(wei)(wei)陽(yang)離子，抗菌(jun)(jun)肽(tai)優(you)先與(yu)細菌(jun)(jun)中(zhong)(zhong)特(te)別豐(feng)富的(de)酸性(xing)(xing)(xing)脂質(zhi)相(xiang)(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)(yong)(yong)（Op den Kamp，1979），從而為(wei)(wei)細胞特(te)異性(xing)(xing)(xing)的(de)差異提供了(le)基(ji)礎（Matsuzaki等人，1995a）。上述特(te)性(xing)(xing)(xing)使這些(xie)肽(tai)成為(wei)(wei)研究脂質(zhi)-蛋白(bai)質(zhi)相(xiang)(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)(yong)(yong)的(de)一個有趣(qu)領域，并可(ke)能進(jin)一步開發(fa)新的(de)抗菌(jun)(jun)、抗癌和(he)(he)(he)抗病毒(du)化合物(wu)(wu)。

我們(men)在(zai)這里報告(gao)了兩種抗(kang)(kang)(kang)菌(jun)(jun)肽(tai)，馬蓋寧2和(he)(he)吲哚青(qing)霉素與(yu)脂(zhi)膜(mo)(mo)相互(hu)(hu)作(zuo)用的(de)(de)比較(jiao)。Magainin和(he)(he)indolicidin根(gen)據其氨基酸(suan)組成和(he)(he)二級(ji)結構屬(shu)于不同的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)菌(jun)(jun)肽(tai)家族(zu)（Falla等(deng)(deng)人(ren)，1996年(nian)）。因此，magainin是(shi)類(lei)脂(zhi)膜(mo)(mo)中(zhong)(zhong)呈(cheng)現兩親性(xing)=-螺(luo)旋結構的(de)(de)一(yi)(yi)個范(fan)例(li)（Matsuzaki，1999），而吲哚肽(tai)屬(shu)于另(ling)一(yi)(yi)個類(lei)脂(zhi)雙層中(zhong)(zhong)具(ju)有(you)(you)獨特氨基酸(suan)組成和(he)(he)非(fei)α-螺(luo)旋構象的(de)(de)類(lei)脂(zhi)（Ladokhin et al.，1999；Ha et al.，2000）。在(zai)非(fei)洲爪蟾爪蟾的(de)(de)皮膚中(zhong)(zhong)發(fa)(fa)現了Magainins，并在(zai)非(fei)溶(rong)血(xue)濃(nong)度下顯示出(chu)廣譜(pu)抗(kang)(kang)(kang)菌(jun)(jun)（Zasloff，1987；Zasloff等(deng)(deng)人(ren)，1988）和(he)(he)抗(kang)(kang)(kang)癌(ai)細胞(bao)活性(xing)（Crucani等(deng)(deng)人(ren)，1991；Baker等(deng)(deng)人(ren)，1993）。為此，有(you)(you)興(xing)趣的(de)(de)青(qing)蛙皮膚提取物已被用于中(zhong)(zhong)醫藥中(zhong)(zhong)的(de)(de)皮膚感染(ran)的(de)(de)控制(zhi)（L.Miao，羅斯基勒(le)大學，個人(ren)通信，2000）。Magainin 2由23個氨基酸(suan)殘基（GIGKFLHSAKKFGKAFVGEIMNS）組成，具(ju)有(you)(you)4的(de)(de)正(zheng)凈電荷，并通過滲透細菌(jun)(jun)膜(mo)(mo)發(fa)(fa)揮(hui)其抗(kang)(kang)(kang)菌(jun)(jun)活性(xing)（Matsuzaki等(deng)(deng)人(ren)，1997年(nian)）。已經提出(chu)形(xing)成肽(tai)-脂(zhi)質(zhi)超分子復(fu)合物孔，允許(xu)離(li)子、脂(zhi)質(zhi)和(he)(he)肽(tai)的(de)(de)跨雙層運輸(shu)，同時跨膜(mo)(mo)電位和(he)(he)脂(zhi)質(zhi)不對(dui)稱性(xing)的(de)(de)耗散(san)（Matsuzaki et al.，1995a，b，c，1996，1998；Ludtke et al.，1996）。magainin對(dui)亞微觀脂(zhi)質(zhi)囊泡作(zuo)用的(de)(de)光譜(pu)和(he)(he)動(dong)力(li)學研究（Matsuzaki等(deng)(deng)人(ren)，1995a，b，c，1996，1998；Ludtke等(deng)(deng)人(ren)，1996）揭(jie)示了相互(hu)(hu)作(zuo)用的(de)(de)協(xie)同性(xing)質(zhi)。然(ran)而，magainin對(dui)膜(mo)(mo)擾動(dong)的(de)(de)確切(qie)機制(zhi)仍存(cun)在(zai)爭議(yi)。

吲(yin)(yin)(yin)哚(duo)(duo)青霉素存在于牛中(zhong)性(xing)(xing)(xing)(xing)粒(li)(li)細(xi)胞的(de)(de)(de)細(xi)胞質(zhi)顆(ke)粒(li)(li)中(zhong)（Selsted等(deng)(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，1992年(nian)(nian)(nian)），具(ju)有(you)(you)獨特的(de)(de)(de)氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)組(zu)成，其13個(ge)(ge)氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)序列中(zhong)有(you)(you)5個(ge)(ge)Trp和(he)3個(ge)(ge)Pro殘基(ji)(ji)（ILPWR）。它(ta)是最短的(de)(de)(de)天然線性(xing)(xing)(xing)(xing)抗(kang)(kang)菌(jun)肽(tai)之一(yi)，與(yu)(yu)magainin類似，對(dui)革(ge)蘭氏陰(yin)性(xing)(xing)(xing)(xing)和(he)陽性(xing)(xing)(xing)(xing)細(xi)菌(jun)（Selsted et al.，1992）和(he)真菌(jun)（Ahmad et al.，1995）以及原生動物(wu)（Aley et al.，1994）具(ju)有(you)(you)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)。吲(yin)(yin)(yin)哚(duo)(duo)西丁對(dui)大鼠和(he)人(ren)(ren)T淋(lin)巴細(xi)胞也(ye)有(you)(you)細(xi)胞毒性(xing)(xing)(xing)(xing)（Schluesener等(deng)(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，1993年(nian)(nian)(nian)），分解紅(hong)細(xi)胞（Ahmad等(deng)(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，1995年(nian)(nian)(nian)），并具(ju)有(you)(you)抗(kang)(kang)HIV-1的(de)(de)(de)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)（Robinson等(deng)(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，1998年(nian)(nian)(nian)）。吲(yin)(yin)(yin)哚(duo)(duo)肽(tai)優先與(yu)(yu)酸(suan)性(xing)(xing)(xing)(xing)磷脂(zhi)結合(he)，盡管它(ta)也(ye)與(yu)(yu)中(zhong)性(xing)(xing)(xing)(xing)磷脂(zhi)結合(he)（Ladokhin等(deng)(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，1997）。已(yi)證明(ming)吲(yin)(yin)(yin)哚(duo)(duo)青霉素可滲透(tou)大腸桿菌(jun)外膜（Falla等(deng)(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，1996年(nian)(nian)(nian)；Subbalakshmi等(deng)(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，1996年(nian)(nian)(nian)），形成通道，如平面(mian)雙層電(dian)導(dao)測量所示(shi)（Falla等(deng)(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，1996年(nian)(nian)(nian)；Wu等(deng)(deng)(deng)(deng)人(ren)(ren)，1999年(nian)(nian)(nian)）。吲(yin)(yin)(yin)哚(duo)(duo)西丁對(dui)細(xi)胞膜的(de)(de)(de)高親和(he)力、不尋常的(de)(de)(de)氨(an)基(ji)(ji)酸(suan)組(zu)成和(he)小體積使其成為一(yi)種有(you)(you)趣的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)菌(jun)劑(ji)。其抗(kang)(kang)菌(jun)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)、電(dian)荷要求(qiu)以及Trp和(he)Pro殘基(ji)(ji)對(dui)生物(wu)活(huo)性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)重(zhong)要性(xing)(xing)(xing)(xing)已(yi)被廣泛研究（Sitaram和(he)Nagaraj，1999）。然而，肽(tai)介(jie)導(dao)的(de)(de)(de)細(xi)胞裂(lie)解的(de)(de)(de)分子機制(zhi)，即肽(tai)是否形成孔隙、像洗滌劑(ji)一(yi)樣溶解膜或誘(you)導(dao)膜缺陷(xian)，仍然存在爭(zheng)議（Sitaram和(he)Nagaraj，1999）。

小的(de)(de)(de)(de)(de)(de)和(he)(he)(he)大(da)(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)單層(ceng)(ceng)囊(nang)(nang)泡（LUV）繼續被廣泛用作模型(xing)膜(mo)。然而(er)，這(zhe)些脂(zhi)質(zhi)體是亞微觀(guan)(guan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)，不(bu)允(yun)許分辨(bian)與(yu)生物(wu)膜(mo)更宏(hong)觀(guan)(guan)變化相關的(de)(de)(de)(de)(de)(de)形(xing)態(tai)學(xue)特征。所謂的(de)(de)(de)(de)(de)(de)巨大(da)(da)(da)囊(nang)(nang)泡（10–500 m）是一(yi)種球(qiu)形(xing)、封閉的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分子雙層(ceng)(ceng)結構，它能包(bao)裹一(yi)個水室，是研(yan)究波動、萌芽、損(sun)傷和(he)(he)(he)愈合的(de)(de)(de)(de)(de)(de)良好模型(xing)，以(yi)及膜(mo)作用試劑誘導的(de)(de)(de)(de)(de)(de)細胞(bao)樣行為(wei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)其他表(biao)現（Riquelme等人，1990年(nian)(nian)；Menger，1998年(nian)(nian)；Menger和(he)(he)(he)Lee，1995年(nian)(nian)；Menger和(he)(he)(he)Keiper，1998年(nian)(nian)；Angelova和(he)(he)(he)Tsoneva，1999年(nian)(nian)；Angelova等人，1999年(nian)(nian)；Holopainen等人，2000年(nian)(nian)）。由于巨大(da)(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)囊(nang)(nang)泡體積大(da)(da)(da)，可(ke)以(yi)通過光學(xue)顯微鏡觀(guan)(guan)察到，從而(er)可(ke)以(yi)直接可(ke)視化涉及超分子化學(xue)和(he)(he)(he)生物(wu)物(wu)理學(xue)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)過程（Luisi和(he)(he)(he)Walde，2000）。在這(zhe)項研(yan)究中，我(wo)們(men)分別使用不(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)(de)膜(mo)模型(xing)，即單層(ceng)(ceng)膜(mo)、大(da)(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)單層(ceng)(ceng)囊(nang)(nang)泡和(he)(he)(he)巨大(da)(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)質(zhi)體，來研(yan)究馬加寧和(he)(he)(he)吲哚西定在膜(mo)中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)滲透，它們(men)對雙層(ceng)(ceng)脂(zhi)質(zhi)動力學(xue)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)影響，以(yi)及膜(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)宏(hong)觀(guan)(guan)形(xing)態(tai)變化。

材料和方法

材料

Hepes、EDTA和(he)(he)magainin 2來自(zi)(zi)(zi)(zi)西格瑪（密蘇(su)里州圣路易斯），吲(yin)哚西丁來自(zi)(zi)(zi)(zi)巴切姆（瑞士布本(ben)多夫(fu)）。經各(ge)自(zi)(zi)(zi)(zi)供應商(shang)提供的(de)(de)高(gao)效(xiao)液相色譜分析驗證，肽的(de)(de)純(chun)度(du)分別(bie)>99%和(he)(he)>95%。通(tong)過質(zhi)譜證實了馬蓋寧2和(he)(he)吲(yin)哚青(qing)霉素的(de)(de)正確分子量和(he)(he)純(chun)度(du)。1-硬脂(zhi)(zhi)酰(xian)(xian)-2-油酰(xian)(xian)基(ji)-sn-甘(gan)(gan)油-3-磷(lin)(lin)酸(suan)膽堿（SOPC）、1-棕櫚(lv)酰(xian)(xian)-2-油酰(xian)(xian)基(ji)-sn-甘(gan)(gan)油-3-磷(lin)(lin)酸(suan)甘(gan)(gan)油（POPG）和(he)(he)>-膽固(gu)醇來自(zi)(zi)(zi)(zi)Avanti極性脂(zhi)(zhi)質(zhi)（Alabaster，AL）。對于熒光(guang)磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)類似物，1-棕櫚(lv)酰(xian)(xian)-2-[10-（芘-1-基(ji)）癸(gui)酰(xian)(xian)]-sn-甘(gan)(gan)油-3-磷(lin)(lin)酸(suan)-rac-甘(gan)(gan)油（PPDPG）和(he)(he)1-棕櫚(lv)酰(xian)(xian)-2-[10-（芘-1-基(ji)）癸(gui)酰(xian)(xian)]-sn-甘(gan)(gan)油-3-磷(lin)(lin)酸(suan)膽堿（PPDPC）來自(zi)(zi)(zi)(zi)K&V Bioware（芬蘭(lan)埃斯波）。二苯基(ji)己三烯（DPH）來自(zi)(zi)(zi)(zi)EGA Chemie（Steinheim，德國）。使用(yong)高(gao)精度(du)電(dian)子天平（Cahn，Cerritos，CA）通(tong)過重量法(fa)測(ce)定(ding)未(wei)標記脂(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)(de)濃度(du)，并使用(yong)摩爾消光(guang)系數分別(bie)為38000 cm-1和(he)(he)88000 cm-1，通(tong)過341 nm處的(de)(de)吸光(guang)度(du)法(fa)測(ce)定(ding)含芘磷(lin)(lin)脂(zhi)(zhi)和(he)(he)DPH的(de)(de)濃度(du)。脂(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)(de)純(chun)度(du)通(tong)過薄層色譜法(fa)在使用(yong)氯仿/甲(jia)醇/水（65:25:4，v/v/v）開發的(de)(de)硅酸(suan)涂層板(ban)（德國達姆施塔(ta)特默克公司）上進行檢查。碘染色后以及適當情況下，紫外(wai)線照射(she)后對平板(ban)進行檢查，未(wei)發現任(ren)何雜質(zhi)。

肽在脂質單層中的滲透

使(shi)用磁攪拌環形聚四氟乙烯孔（多(duo)孔板，亞相體積1.2 ml，芬蘭赫爾(er)辛基基布(bu)隆）測(ce)量(liang)肽對單分(fen)子脂質(zhi)膜的(de)(de)(de)(de)(de)滲透(tou)。表(biao)面壓力(li)（π）通過連接(jie)到連接(jie)到奔騰PC的(de)(de)(de)(de)(de)微量(liang)天平(ping)(ping)（Delta-Pi，Kibron）上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)Wilhelmy線進行(xing)監測(ce)。將脂質(zhi)在氯(lv)仿（~1 mg/ml）中以(yi)指(zhi)定(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)摩(mo)爾(er)比混合(he)，然后(hou)(hou)在該溶劑中擴散到空(kong)氣緩(huan)沖(chong)（5 mM Hepes，0.1 mM EDTA，pH 7.0）界面上(shang)。隨后(hou)(hou)，在向(xiang)亞相注入馬(ma)蓋(gai)寧2或吲哚青霉(mei)素之(zhi)前，讓脂質(zhi)單層在不同(tong)初始(shi)表(biao)面壓力(li)（π0）下平(ping)(ping)衡約(yue)15分(fen)鐘。肽的(de)(de)(de)(de)(de)最(zui)終濃度為1m。注射(she)肽后(hou)(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)增(zeng)量(liang)π在約(yue)30min內完成，初始(shi)表(biao)面壓力(li)（π0）與肽滲透(tou)到膜中后(hou)(hou)觀察到的(de)(de)(de)(de)(de)值(zhi)(zhi)之(zhi)間的(de)(de)(de)(de)(de)差值(zhi)(zhi)取為?π.所示數據表(biao)示三(san)次(ci)測(ce)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)平(ping)(ping)均值(zhi)(zhi)，表(biao)示為?π對π0。所有測(ce)量(liang)均在環境溫(wen)度（~24°C）下進行(xing)。

LUV的制備

指(zhi)示的脂(zhi)質在氯仿中混合，然(ran)(ran)后(hou)在氮氣流(liu)下(xia)去除溶劑，隨后(hou)在減壓下(xia)保持脂(zhi)質殘(can)余至少(shao)2小(xiao)時。然(ran)(ran)后(hou)在50°C下(xia)水(shui)合干燥脂(zhi)質，以(yi)產生1 mM的脂(zhi)質濃度。使用Lipsofast低壓均(jun)質器（加(jia)拿大(da)渥太華Avestin）通過兩個(ge)聚碳酸酯過濾(lv)器（孔徑100 nm，微孔，貝德福德，馬薩諸塞州）的堆疊擠出所得分散體，以(yi)獲得LUV。

Ie/Im的測量

芘(bi)是準分子(zi)形(xing)成有(you)機熒光(guang)團的(de)(de)典范(fan)，其衍生物在(zai)生物分子(zi)研究中得到(dao)了廣泛的(de)(de)應(ying)用。單(dan)體(ti)芘(bi)發(fa)射(she)(she)波(bo)長(chang)(chang)約(yue)(yue)為(wei)(wei)398nm的(de)(de)熒光(guang)，準分子(zi)（激(ji)(ji)發(fa)二聚體(ti)）通(tong)過(guo)發(fa)射(she)(she)波(bo)長(chang)(chang)約(yue)(yue)為(wei)(wei)480nm的(de)(de)熒光(guang)松弛回到(dao)兩個基(ji)態芘(bi)。穩態Ie/Im值(zhi)為(wei)(wei)探針(zhen)碰撞頻率的(de)(de)質(zhi)量(liang)變(bian)化(hua)提供了一個相當好的(de)(de)度(du)量(liang)，反映(ying)了芘(bi)標記(ji)脂(zhi)(zhi)質(zhi)的(de)(de)橫向擴散和局部濃(nong)度(du)（簡要(yao)回顧，見Kinnunen等(deng)人(ren)，1993年；Duportail和Lianos，1996年）。使用Perkin Elmer LS50B熒光(guang)光(guang)譜(pu)儀(yi)和磁(ci)攪拌(ban)恒溫反應(ying)杯室，使用344 nm的(de)(de)激(ji)(ji)發(fa)波(bo)長(chang)(chang)測(ce)量(liang)用PPDPG或PPDPC（X=0.01）標記(ji)的(de)(de)LUV的(de)(de)熒光(guang)發(fa)射(she)(she)光(guang)譜(pu)。激(ji)(ji)發(fa)和發(fa)射(she)(she)均使用5nm的(de)(de)帶寬。使用的(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)濃(nong)度(du)為(wei)(wei)25 M，溫度(du)保持在(zai)25°C。添加適量(liang)肽后，在(zai)記(ji)錄光(guang)譜(pu)之前，樣品(pin)平衡5分鐘。取三次掃描(miao)的(de)(de)平均值(zhi)，分別在(zai)~398和480 nm處測(ce)量(liang)Im和Ie的(de)(de)發(fa)射(she)(she)強度(du)。所有(you)測(ce)量(liang)重(zhong)復三次。

DPH的熒光各向異性

DPH以X=0.002加(jia)入脂質體中。使(shi)用的(de)脂質濃度為(wei)25m，溫度保持在25°C。使(shi)用帶(dai)有(you)Perkin Elmer LS50B的(de)寶麗來型濾(lv)光片以L格(ge)式(shi)測(ce)量偏(pian)振發射。使(shi)用5αnm帶(dai)寬，在360 nm激發和450 nm發射下(xia)測(ce)量DPH的(de)熒光各向異(yi)性(xing)r，并使(shi)用Perkin Elmer提供(gong)的(de)軟(ruan)件程序(xu)計算其值。所有(you)測(ce)量重(zhong)復三次。

巨大脂質體的形成

如其他地(di)方所(suo)述制(zhi)備巨(ju)型(xing)(xing)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體（Angelova和(he)(he)Dimitrov，1986；Holopainen等人，2000）。簡單地(di)說(shuo)，將約1–3 l溶(rong)解在(zai)(zai)二乙醚：甲(jia)醇（9:1，v/v，最終(zhong)總脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)濃度1 mM）中的(de)(de)(de)所(suo)需脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)攤鋪在(zai)(zai)兩個鉑電(dian)極(ji)的(de)(de)(de)表面上，隨后在(zai)(zai)氮氣流下干燥(zao)。在(zai)(zai)真空中抽空1小(xiao)時，去(qu)除可能殘留的(de)(de)(de)有機(ji)溶(rong)劑。在(zai)(zai)蔡司IM-35倒置熒(ying)光顯(xian)微鏡(jing)(jing)的(de)(de)(de)工作(zuo)臺上放置一個帶有附加(jia)(jia)電(dian)極(ji)和(he)(he)石英窗口底部的(de)(de)(de)玻璃室。在(zai)(zai)添加(jia)(jia)1.3 ml pH值為(wei)7.4的(de)(de)(de)0.5 mM Hepes緩沖液(ye)之前(qian)，施加(jia)(jia)交流磁場（頻率為(wei)4 Hz，振幅為(wei)0.2 V的(de)(de)(de)正弦波函數）。在(zai)(zai)水合作(zuo)用(yong)的(de)(de)(de)第(di)一分鐘內，電(dian)壓增加(jia)(jia)到1.0–1.2 V。2–4小(xiao)時后關閉(bi)交流電(dian)場，并使(shi)用(yong)Hoffman調制(zhi)對比度（HMC）光學(xue)系統(tong)和(he)(he)10/0.25物(wu)鏡(jing)(jing)觀察(cha)巨(ju)大(da)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體（調制(zhi)光學(xue)系統(tong)，紐約州紐約）。巨(ju)型(xing)(xing)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)體的(de)(de)(de)大(da)小(xiao)通過微移液(ye)管的(de)(de)(de)運動(dong)校準圖像(xiang)，作(zuo)為(wei)微操作(zuo)器（MX831，帶MC2000控制(zhi)器，SD Instruments，Grants Pass，Oregon）步長（50 nm）的(de)(de)(de)適(shi)當倍數來測量。使(shi)用(yong)帕爾貼冷卻12位數字CCD攝像(xiang)機(ji)（C4742-95，日本濱(bin)松市(shi)濱(bin)松）記(ji)錄圖像(xiang)，該攝像(xiang)機(ji)與計算(suan)機(ji)連接，并由制(zhi)造商提供(gong)的(de)(de)(de)軟件（HiPic 5.0.1）操作(zuo)。

微量注射技術

用(yong)微處(chu)理器控(kong)制的(de)(de)(de)水(shui)平(ping)拉(la)拔器（P-87，Sutter Instrument Co.，加利福尼亞州(zhou)諾(nuo)瓦托）用(yong)硼硅酸鹽(yan)毛細管（外徑1.2-mm）制成(cheng)內徑>0.5 m的(de)(de)(de)微量移液管（Schnorf et al.，1994）。指示量的(de)(de)(de)肽溶(rong)液（10mmHEPES中的(de)(de)(de)0.5mm，0.1mmEDTA，pH 7.0）以氣動微注射器（PLI-100，醫療系(xi)統公司(si)，紐約州(zhou)格(ge)林維爾）輸送的(de)(de)(de)一系(xi)列單次注射~20FL的(de)(de)(de)形式應用(yong)于單個巨(ju)大囊泡的(de)(de)(de)外表(biao)面。為便于操作，僅使用(yong)附著(zhu)在(zai)電極表(biao)面的(de)(de)(de)囊泡。所(suo)有實(shi)驗均在(zai)環境溫度(du)（~24°C）下進(jin)行，并重復至(zhi)少10次。