摘要

利(li)用振(zhen)動(dong)和(he)(he)頻(pin)產生(sheng)、表(biao)面(mian)(mian)(mian)壓(ya)力測量(liang)和(he)(he)熒光顯微鏡研究了鈉離(li)(li)子(zi)和(he)(he)鈣(gai)離(li)(li)子(zi)對(dui)兩性離(li)(li)子(zi)和(he)(he)陰(yin)離(li)(li)子(zi)磷脂(zhi)(zhi)單分子(zi)膜的(de)影響。鈉離(li)(li)子(zi)對(dui)單層(ceng)結(jie)構的(de)影響很小，而(er)鈣(gai)離(li)(li)子(zi)的(de)影響很大(da)，并(bing)且強(qiang)烈依賴于表(biao)面(mian)(mian)(mian)壓(ya)力。在(zai)低表(biao)面(mian)(mian)(mian)壓(ya)力下(～5 mN/m），Ca2+的(de)存在(zai)導致意外出現(xian)有(you)序(xu)結(jie)構域(yu)。對(dui)于壓(ya)力介(jie)于～5和(he)(he)～25 mN/m，Ca2+離(li)(li)子(zi)誘(you)導單層(ceng)細胞紊亂。當壓(ya)力超過25 mN/m時，鈣(gai)離(li)(li)子(zi)擴展單層(ceng)，同時使脂(zhi)(zhi)鏈有(you)序(xu)化(hua)(hua)。有(you)趣的(de)是，兩性離(li)(li)子(zi)脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)和(he)(he)帶負電脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)的(de)效(xiao)果相似。在(zai)振(zhen)動(dong)和(he)(he)頻(pin)產生(sheng)和(he)(he)表(biao)面(mian)(mian)(mian)張力測量(liang)中，Ca2+與脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)結(jie)合(he)(he)的(de)分子(zi)特征從Ca2+誘(you)導的(de)信號變(bian)化(hua)(hua)中可以明顯看出，對(dui)應(ying)于4?2/Lipid9的(de)面(mian)(mian)(mian)積變(bian)化(hua)(hua)精確(que)地說是Ca2+離(li)(li)子(zi)的(de)表(biao)面(mian)(mian)(mian)積，并(bing)有(you)證據表(biao)明在(zai)高壓(ya)下脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)Ca2+絡(luo)合(he)(he)發生(sheng)變(bian)化(hua)(hua)。

介紹

細胞的(de)(de)(de)(de)質(zhi)(zhi)膜(mo)由許多不同的(de)(de)(de)(de)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)組成，這(zhe)些磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)不對稱地分布在兩個雙(shuang)層(ceng)小(xiao)葉上(shang)。胞質(zhi)(zhi)小(xiao)葉富含(han)陰離(li)子(zi)(zi)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)酰絲(si)氨酸（PS）磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)，而(er)細胞外(wai)小(xiao)葉主要含(han)有中性兩性脂(zhi)質(zhi)(zhi)。膜(mo)脂(zhi)的(de)(de)(de)(de)性質(zhi)(zhi)在很大程度(du)上(shang)取(qu)決于環境(jing)條件，如pH值和離(li)子(zi)(zi)強(qiang)度(du)。膜(mo)脂(zhi)與(yu)離(li)子(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)相(xiang)互作用(yong)本課(ke)題在膜(mo)融(rong)合(he)、酶調節、信號(hao)轉導等許多生物過程中起著(zhu)重要作用(yong)。1-4由于其負電荷(he)，PS磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)吸引陽離(li)子(zi)(zi)，如鈉和鈣。這(zhe)可(ke)以用(yong)雙(shuang)電層(ceng)的(de)(de)(de)(de)古伊-查普曼理(li)論來解釋，該理(li)論預(yu)測負電荷(he)表(biao)(biao)面(mian)(mian)附近的(de)(de)(de)(de)離(li)子(zi)(zi)濃度(du)會局部增加。5另一方面(mian)(mian)，金屬離(li)子(zi)(zi)與(yu)兩性離(li)子(zi)(zi)磷(lin)(lin)(lin)脂(zhi)酰膽(dan)堿（PC）脂(zhi)質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)頭基之間的(de)(de)(de)(de)相(xiang)互作用(yong)預(yu)計與(yu)PS相(xiang)比相(xiang)對較弱(ruo)。然(ran)而(er)，校正了表(biao)(biao)面(mian)(mian)電位(wei)的(de)(de)(de)(de)差異后，發現離(li)子(zi)(zi)與(yu)PC和PS的(de)(de)(de)(de)結(jie)合(he)常數相(xiang)似。6此外(wai)，PC頭群(qun)方向(xiang)的(de)(de)(de)(de)微小(xiao)變化(hua)可(ke)顯著(zhu)改變膜(mo)表(biao)(biao)面(mian)(mian)的(de)(de)(de)(de)電性能。7,8

除了一個(ge)基(ji)本的(de)興(xing)趣(qu)，陽(yang)離(li)子(zi)與(yu)PC膜的(de)結合在(zai)(zai)更實際的(de)應(ying)用(yong)(yong)中受到(dao)了特別的(de)關注。9,10最近，研究表明，在(zai)(zai)Ca2+存在(zai)(zai)的(de)情況下，DNA與(yu)兩性(xing)離(li)子(zi)脂質之間的(de)相(xiang)互(hu)作用(yong)(yong)通過靜(jing)電(dian)相(xiang)互(hu)作用(yong)(yong)強(qiang)烈增強(qiang)。因(yin)此，它們可以作為(wei)DNA轉染的(de)合適(shi)載體，因(yin)為(wei)兩性(xing)離(li)子(zi)脂質與(yu)大多數陽(yang)離(li)子(zi)脂質相(xiang)比(bi)無毒且(qie)生物(wu)相(xiang)容。

迄今為止，大多數(shu)實驗研究主(zhu)要旨在量化離子(zi)和脂質(zhi)之間的固有結合常(chang)數(shu)，以及表(biao)(biao)征(zheng)膜表(biao)(biao)面(mian)電位(wei)。除了(le)分子(zi)動力學（MD）研究外，對(dui)脂類和離子(zi)之間相(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)的分子(zi)細節(jie)的11-16見解仍然有限。MD模擬表(biao)(biao)明，鈉(na)離子(zi)通(tong)過與(yu)磷酸二酯氧(yang)相(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)特異性地結合到PC雙層(ceng)膜上；11深(shen)度滲透后，離子(zi)可與(yu)羰基(ji)配(pei)位(wei)。13另一方面(mian)，二價陽離子(zi)（如鈣(gai)）不能深(shen)入到陰離子(zi)PS雙層(ceng)膜中，位(wei)于磷酸基(ji)團周圍的狹窄(zhai)區域。14當陽離子(zi)結合到膜上時(shi)，脂頭基(ji)團發生(sheng)構(gou)象(xiang)變(bian)化，隨后脂尾順序增加。11,13,14

盡管使用(yong)MD模擬(ni)進(jin)行(xing)了(le)(le)大(da)量的(de)努力，但仍然存在(zai)一(yi)些有爭議的(de)問題，12、15、16部分源于不(bu)同(tong)的(de)模擬(ni)時間，可能是不(bu)同(tong)模擬(ni)中的(de)電位選(xuan)擇。此(ci)外，迄今為止的(de)報告僅(jin)限于一(yi)種特(te)定(ding)的(de)脂質(zhi)(zhi)密度，即每個分子的(de)一(yi)個面積(ji)。因此(ci)，需要對離子-脂質(zhi)(zhi)相(xiang)互(hu)(hu)作(zuo)用(yong)進(jin)行(xing)實驗研究，特(te)別是在(zai)不(bu)同(tong)的(de)脂質(zhi)(zhi)密度下，以(yi)補充現有的(de)理論工(gong)作(zuo)。我們(men)在(zai)這(zhe)里討論了(le)(le)PC和(he)PS脂質(zhi)(zhi)之間的(de)相(xiang)互(hu)(hu)作(zuo)用(yong)以(yi)及不(bu)同(tong)脂質(zhi)(zhi)密度和(he)相(xiang)的(de)單價(jia)和(he)二(er)價(jia)陽離子之間的(de)相(xiang)互(hu)(hu)作(zuo)用(yong)。在(zai)空氣-水(shui)界面的(de)脂質(zhi)(zhi)單分子膜中，我們(men)研究了(le)(le)離子磷脂復合物的(de)形成以(yi)及在(zai)一(yi)系(xi)列(lie)脂質(zhi)(zhi)密度的(de)單組分膜中離子誘(you)導(dao)的(de)脂質(zhi)(zhi)重組。

使用三(san)種互補(bu)技術的(de)(de)組合研(yan)究陽離子脂(zhi)質單(dan)(dan)層系統，這(zhe)三(san)種技術提(ti)供不(bu)同長(chang)度尺(chi)度的(de)(de)信(xin)息(xi)：表面(mian)(mian)(mian)壓力測量、熒光顯微鏡和振(zhen)動和頻產(chan)生（VSFG）光譜。表面(mian)(mian)(mian)壓力與面(mian)(mian)(mian)積的(de)(de)等(deng)溫線(xian)形成(cheng)了整個單(dan)(dan)層相行為(wei)(wei)的(de)(de)宏觀測量。熒光顯微鏡下，17-19脂(zhi)質結(jie)構域可(ke)通過(guo)～200 nm分辨率，而VSFG提(ti)供關(guan)于脂(zhi)質分子取向和構象的(de)(de)信(xin)息(xi)，20-24，盡管平均探測面(mian)(mian)(mian)積為(wei)(wei)～10-2 mm2。請(qing)注(zhu)意，SFG對(dui)有(you)序(xu)(xu)結(jie)構域最敏感(gan)，因為(wei)(wei)有(you)序(xu)(xu)結(jie)構域提(ti)供的(de)(de)信(xin)號(hao)比無序(xu)(xu)結(jie)構域大(da)得多，因為(wei)(wei)有(you)序(xu)(xu)結(jie)構域的(de)(de)對(dui)稱性降低。

脂質(zhi)單分子(zi)(zi)膜(mo)(mo)被(bei)廣泛用(yong)(yong)作生物膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)模(mo)型系(xi)統，因(yin)為(wei)細(xi)胞膜(mo)(mo)可以(yi)被(bei)視為(wei)兩個弱耦合(he)的(de)(de)(de)單分子(zi)(zi)膜(mo)(mo)。25對(dui)(dui)空(kong)氣-水界(jie)面上的(de)(de)(de)脂質(zhi)單層的(de)(de)(de)研究進(jin)一(yi)步(bu)允許對(dui)(dui)表面壓力(li)進(jin)行實驗(yan)控(kong)制。為(wei)了觀察陽離(li)子(zi)(zi)對(dui)(dui)單層組織的(de)(de)(de)細(xi)微影響，使用(yong)(yong)了相對(dui)(dui)較高(gao)（1 M）濃(nong)度的(de)(de)(de)陽離(li)子(zi)(zi)。先(xian)前的(de)(de)(de)研究表明，需要如此(ci)高(gao)的(de)(de)(de)濃(nong)度才能獲得離(li)子(zi)(zi)與大多數脂質(zhi)分子(zi)(zi)相互作用(yong)(yong)的(de)(de)(de)顯(xian)著效(xiao)果。26,27雖然(ran)我們在這里報(bao)(bao)告(gao)了1 M濃(nong)度的(de)(de)(de)結果，但對(dui)(dui)照實驗(yan)表明，這里報(bao)(bao)告(gao)的(de)(de)(de)效(xiao)應影響了離(li)子(zi)(zi)濃(nong)度高(gao)于50 mM的(de)(de)(de)大多數脂質(zhi)。

研究了兩性離(li)子脂質(zhi)L-1,2-二棕(zong)櫚酰-sn-甘油(you)-3-磷(lin)酸膽堿（DPPC）和(he)(he)帶負電脂質(zhi)L-1,2-二甲基-sn-甘油(you)-3-磷(lin)酸絲氨(an)酸（DMPS）的(de)陽離(li)子-脂質(zhi)相互作用(yong)。脂質(zhi)的(de)結構如圖1所(suo)示(shi)。DMPS和(he)(he)DPPC單(dan)分子膜表(biao)現(xian)出非常相似的(de)相行為，都顯示(shi)出不同(tong)的(de)共存區域。28 DPPC和(he)(he)DMP都有飽和(he)(he)烷(wan)基鏈(lian)，烴鏈(lian)的(de)長度略(lve)有不同(tong)。因此(ci)，這兩種不同(tong)類型的(de)脂質(zhi)呈現(xian)出良好的(de)模型系統(tong)，其中陽離(li)子-脂質(zhi)相互作用(yong)可(ke)以遵循不同(tong)的(de)階段，并且可(ke)以揭示(shi)脂質(zhi)頭基電荷的(de)影響。

圖1：。DPPC和DMPS的化學結構

關于DPPC和(he)DMPS之間離子(zi)(zi)-脂質(zhi)相互作用的比(bi)較，估計鈣(gai)與中(zhong)性脂質(zhi)的結(jie)合(he)(he)常數(shu)為12 M-1<K<20 M-1。因此，在1 M CaCl2溶(rong)液中(zhong)，90%以上(shang)(shang)的DPPC脂質(zhi)將與鈣(gai)結(jie)合(he)(he)。在DMP上(shang)(shang)，需要考慮負表面(mian)電(dian)荷，這將吸引陽(yang)離子(zi)(zi)。然而，由(you)于中(zhong)性單分子(zi)(zi)層(ceng)幾乎(hu)所有表面(mian)位(wei)點都(dou)已結(jie)合(he)(he)，這不會顯(xian)著(zhu)改(gai)變結(jie)合(he)(he)脂質(zhi)的比(bi)例(li)。因此，在高電(dian)解(jie)質(zhi)濃度（1 M）下(xia)，可以有意義地比(bi)較DPPC和(he)DMPS。

我們發現，鈉離(li)子(zi)對DPPC單(dan)(dan)分子(zi)膜的(de)(de)(de)影(ying)響不大，而鈣離(li)子(zi)顯著(zhu)干擾脂質(zhi)(zhi)組織(zhi)。令人驚訝的(de)(de)(de)是，鈣對脂質(zhi)(zhi)組織(zhi)的(de)(de)(de)影(ying)響（即誘導(dao)(dao)有(you)序(xu)(xu)(xu)(xu)或(huo)無(wu)序(xu)(xu)(xu)(xu)）強烈(lie)依賴于(yu)(yu)表面(mian)壓(ya)(ya)(ya)力(li)π。在(zai)(zai)低(di)(di)表面(mian)壓(ya)(ya)(ya)力(li)下(xia)(xia)(～5 mN/m）Ca2+的(de)(de)(de)存在(zai)(zai)觸發有(you)序(xu)(xu)(xu)(xu)結(jie)構域的(de)(de)(de)出(chu)現，在(zai)(zai)中壓(ya)(ya)(ya)下(xia)(xia)，Ca2+傾向于(yu)(yu)弱無(wu)序(xu)(xu)(xu)(xu)單(dan)(dan)層，在(zai)(zai)高壓(ya)(ya)(ya)（π>20 mN/m）下(xia)(xia)，通過(guo)與頭部基(ji)團(tuan)的(de)(de)(de)相互(hu)作(zuo)用(yong)，在(zai)(zai)脂尾中誘導(dao)(dao)大量(liang)有(you)序(xu)(xu)(xu)(xu)。DPPC和DMPS的(de)(de)(de)這些效應相似，這表明(ming)鈣離(li)子(zi)與相同的(de)(de)(de)頭基(ji)部分相互(hu)作(zuo)用(yong)，最有(you)可能是磷酸(suan)基(ji)團(tuan)（見(jian)圖1）。已知鈣和磷酸(suan)鹽(yan)在(zai)(zai)水中形成強離(li)子(zi)對29，并且這種相互(hu)作(zuo)用(yong)的(de)(de)(de)強度可能會(hui)在(zai)(zai)類脂頭群(qun)區域增加(jia)，在(zai)(zai)該區域周圍(wei)的(de)(de)(de)介電常數（因此(ci)電荷的(de)(de)(de)靜電屏蔽）會(hui)降(jiang)低(di)(di)。這并不排除Ca2+與DMP絲氨酸(suan)基(ji)團(tuan)上負電荷的(de)(de)(de)任(ren)何相互(hu)作(zuo)用(yong)，但如(ru)果發生這種情況，則不會(hui)影(ying)響脂尾的(de)(de)(de)順(shun)序(xu)(xu)(xu)(xu)。鈉離(li)子(zi)的(de)(de)(de)存在(zai)(zai)對DMP有(you)更顯著(zhu)的(de)(de)(de)影(ying)響，與Ca2+相比，在(zai)(zai)高壓(ya)(ya)(ya)下(xia)(xia)，脂質(zhi)(zhi)順(shun)序(xu)(xu)(xu)(xu)降(jiang)低(di)(di)。