摘要

膜(mo)(mo)脂是(shi)細胞(bao)功(gong)能(neng)(neng)的(de)(de)(de)(de)(de)積極貢獻者，是(shi)控(kong)制細胞(bao)功(gong)能(neng)(neng)（包括炎癥、凋亡(wang)、遷移和(he)增殖）的(de)(de)(de)(de)(de)信號(hao)通路中的(de)(de)(de)(de)(de)關(guan)(guan)鍵(jian)介質。最近關(guan)(guan)于多分子(zi)(zi)(zi)脂質結(jie)(jie)構的(de)(de)(de)(de)(de)研究表(biao)明，脂質組(zu)織在調(diao)節脂質和(he)蛋白質功(gong)能(neng)(neng)方(fang)面(mian)起(qi)著關(guan)(guan)鍵(jian)作(zuo)用(yong)。在這(zhe)(zhe)方(fang)面(mian)，人們特(te)別感興(xing)趣的(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)多磷(lin)酸(suan)(suan)肌醇（PPI），尤其是(shi)磷(lin)脂酰肌醇（4,5）二磷(lin)酸(suan)(suan)（PIP2）。PIP2的(de)(de)(de)(de)(de)細胞(bao)功(gong)能(neng)(neng)眾(zhong)多，但(dan)PIP2在質膜(mo)(mo)內小葉中的(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)織，以及控(kong)制PIP2靶向特(te)定(ding)蛋白質的(de)(de)(de)(de)(de)因素(su)，仍知(zhi)之甚少。為(wei)了在一個簡(jian)化的(de)(de)(de)(de)(de)平面(mian)系統中分析PIP2的(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)織，我們使用(yong)Langmuir單(dan)(dan)分子(zi)(zi)(zi)膜(mo)(mo)來(lai)研究亞相(xiang)條件對純化的(de)(de)(de)(de)(de)天然衍生(sheng)PIP2和(he)其他(ta)陰(yin)離子(zi)(zi)(zi)或兩性磷(lin)脂單(dan)(dan)分子(zi)(zi)(zi)膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)影響。我們報告了在生(sheng)物相(xiang)關(guan)(guan)表(biao)面(mian)密度(du)下，亞相(xiang)單(dan)(dan)價鹽(yan)對PIP2的(de)(de)(de)(de)(de)顯(xian)著分子(zi)(zi)(zi)面(mian)積擴展效應。這(zhe)(zhe)種效應對PIP2具有特(te)異性，且與亞相(xiang)pH無關(guan)(guan)。破壞水(shui)(shui)結(jie)(jie)構和(he)水(shui)(shui)介導分子(zi)(zi)(zi)間氫(qing)鍵(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)能(neng)(neng)力的(de)(de)(de)(de)(de)潮向性試劑（例如鹽(yan)、海藻糖、尿素(su)、溫(wen)度(du)）也特(te)異性地(di)擴展了PIP2單(dan)(dan)分子(zi)(zi)(zi)膜(mo)(mo)。這(zhe)(zhe)些(xie)結(jie)(jie)果(guo)表(biao)明，在確定(ding)PIP2的(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)織時，水(shui)(shui)介導的(de)(de)(de)(de)(de)氫(qing)鍵(jian)和(he)頭(tou)基排(pai)斥(chi)作(zuo)用(yong)相(xiang)結(jie)(jie)合，可能(neng)(neng)有助于解釋PIP2與其他(ta)陰(yin)離子(zi)(zi)(zi)磷(lin)脂相(xiang)比(bi)的(de)(de)(de)(de)(de)獨特(te)功(gong)能(neng)(neng)。

介紹

磷脂酰(xian)肌醇(chun)4,5-二磷酸(suan)(suan)（PI（4,5）P2或PIP2）是膜結(jie)合脂質(zhi)中唯一(yi)重要的(de)細(xi)胞功能(neng)調(diao)節因(yin)子。盡管PIP2結(jie)構(gou)簡(jian)單，在細(xi)胞中相對(dui)缺乏（<所有膜脂1,2的(de)1%），但PIP2是多(duo)種細(xi)胞過程的(de)關鍵介質(zhi)。PIP2最廣為認可的(de)功能(neng)是作為底物，通過磷脂酶(mei)(mei)C（PLC）水解裂解為二酰(xian)甘油（DAG）和(he)三磷酸(suan)(suan)肌醇(chun)（IP3），這(zhe)分別(bie)是蛋白(bai)(bai)激酶(mei)(mei)C和(he)鈣信(xin)號的(de)效應(ying)器(qi)（參(can)考文獻3中進行了綜述），并(bing)通過PI 3-激酶(mei)(mei)4磷酸(suan)(suan)化(hua)生成信(xin)號脂質(zhi)PIP3。PIP2本身參(can)與多(duo)種信(xin)號通路，并(bing)參(can)與調(diao)節負責肌動(dong)蛋白(bai)(bai)細(xi)胞骨(gu)架的(de)維持和(he)動(dong)力學(xue)的(de)蛋白(bai)(bai)質(zhi)，5,6這(zhe)些細(xi)胞骨(gu)架結(jie)構(gou)與質(zhi)膜的(de)附著，7膜運輸和(he)附著的(de)調(diao)節，9離子通道活性，10和(he)突觸囊泡融合。11

多小啊(～1kD）膜(mo)結(jie)(jie)合分(fen)子(zi)（如(ru)PIP2）對大量結(jie)(jie)構(gou)多樣的(de)(de)結(jie)(jie)合伙伴具有(you)如(ru)此多的(de)(de)特異性作用(yong)(yong)，目(mu)前尚不清楚(chu)。一(yi)(yi)些證(zheng)據表明(ming)，PIP2信(xin)號的(de)(de)控制(zhi)不僅來(lai)自于酶對其(qi)(qi)豐度(du)的(de)(de)調(diao)節，還來(lai)自于對其(qi)(qi)空間(jian)組織的(de)(de)調(diao)節。支(zhi)持這一(yi)(yi)假設(she)的(de)(de)第一(yi)(yi)個證(zheng)據是(shi)發現細胞膜(mo)中PIP2的(de)(de)重(zhong)要部(bu)分(fen)不可(ke)用(yong)(yong)于PLC水(shui)解，12,13以(yi)及體(ti)外PLC活(huo)性對單層中PIP2濃度(du)的(de)(de)依(yi)賴性。12種耐去(qu)污劑膜(mo)組分(fen)被證(zheng)明(ming)富含PIP2，14,15可(ke)能(neng)(neng)表明(ming)PIP2定(ding)位于膜(mo)筏。使用(yong)(yong)GFP標記的(de)(de)PIP2結(jie)(jie)合域9,16和熒光抗PIP2抗體(ti)15,17的(de)(de)成像方(fang)法同樣證(zheng)實了空間(jian)上不同的(de)(de)PIP2組分(fen)的(de)(de)可(ke)能(neng)(neng)性。盡管這些結(jie)(jie)構(gou)域的(de)(de)存在及其(qi)(qi)功能(neng)(neng)意義存在爭議，18,19 PIP2的(de)(de)空間(jian)分(fen)離仍(reng)然是(shi)調(diao)節這一(yi)(yi)關鍵脂(zhi)質信(xin)使的(de)(de)一(yi)(yi)種可(ke)能(neng)(neng)機制(zhi)。

盡管有越來越多的(de)(de)(de)證據表明PIP2存在(zai)空間(jian)(jian)上不同的(de)(de)(de)池，但(dan)此類域(yu)的(de)(de)(de)形成機制尚未(wei)確定。一(yi)些研究表明，蛋白(bai)質(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)非結(jie)構(gou)化(hua)多元酸結(jie)構(gou)域(yu)（特別是MARKs）與(yu)(yu)多個PIP2分(fen)子(zi)(zi)之間(jian)(jian)存在(zai)相(xiang)(xiang)互(hu)(hu)作(zuo)用(yong)(yong)，允許通過非特異性(xing)靜電吸引2、15、20–23濃(nong)縮這種脂質(zhi)(zhi)，并屏蔽脂質(zhi)(zhi)與(yu)(yu)其他潛(qian)在(zai)的(de)(de)(de)細胞靶點(dian)。該假說(shuo)認為相(xiang)(xiang)鄰PIP2分(fen)子(zi)(zi)之間(jian)(jian)的(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)互(hu)(hu)作(zuo)用(yong)(yong)主(zhu)要由電荷密集(ji)的(de)(de)(de)聚陰離子(zi)(zi)頭基之間(jian)(jian)的(de)(de)(de)靜電排斥作(zuo)用(yong)(yong)決定。另一(yi)方(fang)面，最近對含有PIP2的(de)(de)(de)脂質(zhi)(zhi)體進行的(de)(de)(de)實驗表明，由于(yu)氫鍵(jian)的(de)(de)(de)吸引力相(xiang)(xiang)互(hu)(hu)作(zuo)用(yong)(yong)，PIP2結(jie)構(gou)域(yu)的(de)(de)(de)存在(zai)與(yu)(yu)蛋白(bai)質(zhi)(zhi)無(wu)關。24,25

在(zai)(zai)這(zhe)里(li)，我們展示了純天(tian)然衍(yan)生PIP2單分(fen)(fen)子膜(mo)的(de)(de)(de)實驗結果，這(zhe)些單分(fen)(fen)子膜(mo)強烈支持(chi)相鄰PIP2分(fen)(fen)子之間存在(zai)(zai)吸引相互作用(yong)，從而反對陰離子頭(tou)(tou)基的(de)(de)(de)靜(jing)電排(pai)斥。比較PIP2與其他(ta)酸(suan)性磷脂在(zai)(zai)一系(xi)列(lie)亞相條件下的(de)(de)(de)面(mian)積壓力(li)等溫線(xian)，揭(jie)示了靜(jing)電效應對膜(mo)表面(mian)壓力(li)的(de)(de)(de)影響程(cheng)度。幾種不帶電的(de)(de)(de)潮向性的(de)(de)(de)影響排(pai)除了嚴格的(de)(de)(de)靜(jing)電解釋，并突(tu)出了氫鍵(jian)或脂頭(tou)(tou)基團水合作用(yong)在(zai)(zai)維持(chi)平面(mian)系(xi)統中PIP2物(wu)理狀(zhuang)態中的(de)(de)(de)重要性。最后，觀察到(dao)的(de)(de)(de)效應對其他(ta)陰離子和肌(ji)醇(chun)基脂質的(de)(de)(de)特異性表明，PI（4,5）P2可能具(ju)有形成氫鍵(jian)網(wang)絡的(de)(de)(de)獨特能力(li)，作為其結構和功能隔離的(de)(de)(de)機(ji)制。

方法

脂(zhi)質和試劑。天然脂(zhi)質（牛肝(gan)L-R-磷(lin)脂(zhi)酰(xian)肌(ji)(ji)醇(chun)(chun)、豬(zhu)腦(nao)L-R-磷(lin)脂(zhi)酰(xian)肌(ji)(ji)醇(chun)(chun)-4-磷(lin)酸(suan)(suan)(suan)、豬(zhu)腦(nao)L-R-磷(lin)脂(zhi)酰(xian)絲氨酸(suan)(suan)(suan)和豬(zhu)腦(nao)L-Rphosphatidylinositol-4,5-二(er)磷(lin)酸(suan)(suan)(suan)）以(yi)(yi)1 mg/mL溶(rong)液（PPI用氯(lv)仿/甲醇(chun)(chun)/水(shui)20:9:1；PS用氯(lv)仿）的形式(shi)從Avanti（Alabaster，AL）購(gou)買，并(bing)(bing)儲存在-20°C下(xia)。合(he)成PIP2類(lei)似物(wu)（Avanti，二(er)油基(ji)磷(lin)脂(zhi)酰(xian)肌(ji)(ji)醇(chun)(chun)（x，y）二(er)磷(lin)酸(suan)(suan)(suan)）以(yi)(yi)干燥的0.1 mg等份購(gou)買，溶(rong)解在所提供的溶(rong)劑中(zhong)，并(bing)(bing)儲存在-20°C下(xia)。在有(you)機成分(fen)(fen)酸(suan)(suan)(suan)消化后(hou)(hou)，首先(xian)通過磷(lin)酸(suan)(suan)(suan)鹽分(fen)(fen)析確(que)認脂(zhi)質溶(rong)液的濃度26，隨(sui)后(hou)(hou)通過與每(mei)個脂(zhi)質分(fen)(fen)子的測量面積進行(xing)比(bi)較(jiao)來確(que)認。亞(ya)相試劑HEPES、EDTA、D-海藻糖和尿素從Sigma（密(mi)蘇(su)里州(zhou)(zhou)圣(sheng)路易斯(si)）購(gou)買，CsCl、NaCl、KCl、LiCl、MgCl2和CaCl2從Fisher（NH州(zhou)(zhou)漢(han)普(pu)頓(dun)）購(gou)買。

壓(ya)力(li)(li)面(mian)(mian)(mian)積等溫(wen)線(xian)。用10 mM HEPES，0.1 mM EDTA，pH 7.4溶(rong)解于18.2 M中制備(bei)單層亞相(xiang)?ddH2O。對于低pH實驗，緩沖(chong)液(ye)為(wei)10 mM磷(lin)酸(suan)鈉；通過(guo)(guo)0.2μm注射器(qi)過(guo)(guo)濾(lv)器(qi)（Sigma）過(guo)(guo)濾(lv)25-30 mL亞相(xiang)溶(rong)液(ye)，并(bing)(bing)將其添加(jia)到MicroTroughX Langmuir槽中（芬蘭赫爾辛基(ji)Kibron股份(fen)有限公司(si)）。通過(guo)(guo)隔膜(mo)從-20°C下(xia)儲(chu)存的(de)(de)(de)容(rong)器(qi)中提取約7 nmol的(de)(de)(de)脂(zhi)質(zhi)，以防(fang)止溶(rong)劑蒸(zheng)發(fa)，并(bing)(bing)緩慢沉(chen)積在亞相(xiang)表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)。在單層穩定(ding)10分鐘(zhong)后，通過(guo)(guo)使(shi)用微(wei)步電(dian)機移(yi)動(dong)槽的(de)(de)(de)屏(ping)(ping)障(zhang)，以15?2/分子(zi)(zi)/分鐘(zhong)的(de)(de)(de)速度壓(ya)縮(suo)脂(zhi)質(zhi)。使(shi)用Wilhelmy method26和FilmWare軟件包（Kibron）使(shi)用表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)探針監測單層表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)壓(ya)力(li)(li)。脂(zhi)質(zhi)含量低和沉(chen)積速度慢是單層等溫(wen)線(xian)重現性(xing)的(de)(de)(de)關鍵參數(shu)。純PIP2的(de)(de)(de)單層不能被壓(ya)縮(suo)過(guo)(guo)去～在我們的(de)(de)(de)實驗中，37 mN/m，因為(wei)微(wei)槽的(de)(de)(de)特(te)氟隆涂層屏(ping)(ping)障(zhang)在高表(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)PIP2濃度下(xia)潤濕；因此，無法測量PIP2單分子(zi)(zi)膜(mo)的(de)(de)(de)坍塌(ta)壓(ya)力(li)(li)，但其下(xia)限至少為(wei)37 mN/m。使(shi)用循環水(shui)浴維持子(zi)(zi)相(xiang)的(de)(de)(de)溫(wen)度。

時程實驗(yan)。將(jiang)約0.01 nmol的(de)(de)(de)PIP2沉積(ji)在1 mL過濾子相(xiang)的(de)(de)(de)界面(mian)(mian)上，并(bing)將(jiang)其添(tian)加(jia)到(dao)多孔(kong)板（Kibron）的(de)(de)(de)單孔(kong)中。添(tian)加(jia)脂(zhi)質(zhi)，直到(dao)表(biao)面(mian)(mian)壓力增加(jia)到(dao)15-20 mN/m之間。脂(zhi)質(zhi)保持穩定～30分(fen)鐘(zhong)，直到(dao)表(biao)面(mian)(mian)壓力穩定（在1 mN/m范(fan)圍內）幾(ji)分(fen)鐘(zhong)。通過進樣(yang)口(kou)將(jiang)50μL 5 M NaCl添(tian)加(jia)到(dao)亞相(xiang)中，并(bing)測量表(biao)面(mian)(mian)壓力隨時間的(de)(de)(de)變化。