結果

純天然PIP2的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)行為(wei)。通過將(jiang)PIP2單(dan)(dan)分(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)膜(mo)(mo)從250?2/分(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)壓(ya)(ya)縮至50?2/分(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)，并(bing)觀察壓(ya)(ya)縮對界(jie)面(mian)表(biao)面(mian)壓(ya)(ya)力的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)影響，研究了純天然衍(yan)生PIP2的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)面(mian)壓(ya)(ya)力（π）與分(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)面(mian)積之間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)關系(xi)。10個單(dan)(dan)獨試驗的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)平(ping)均(jun)等溫線如(ru)圖1a所(suo)示。正(zheng)如(ru)純PIP2酰基鏈的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)已知組成所(suo)預期的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)那樣(～50%不飽和，33%花生四烯酸），隨著分(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)面(mian)積的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)減小(xiao)，這(zhe)(zhe)些等溫線顯示出表(biao)面(mian)壓(ya)(ya)力平(ping)滑、單(dan)(dan)調的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)增加(jia)。在這(zhe)(zhe)些實驗中使用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)任何條件下(xia)，均(jun)未(wei)觀察到(dao)PIP2單(dan)(dan)分(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)膜(mo)(mo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)變。與生理條件相(xiang)(xiang)對應的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)面(mian)壓(ya)(ya)力下(xia)PIP2的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)平(ping)均(jun)面(mian)積(～30 mN/m 27）為(wei)73.1（3.0?2/分(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)，略大(da)于SAPC（65?2）的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)公(gong)布值(zhi)，28這(zhe)(zhe)是根(gen)據(ju)糖頭(tou)基的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)添加(jia)體積和靜電排斥預期的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)。盡(jin)管在生理pH下(xia)PIP2頭(tou)基的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)大(da)小(xiao)和相(xiang)(xiang)對較高(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)電荷密度，但該分(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)很容易形成緊密壓(ya)(ya)縮的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)(dan)分(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)膜(mo)(mo)，而(er)不是在較高(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表(biao)面(mian)壓(ya)(ya)力下(xia)坍塌成水膠束結構(gou)。在所(suo)有條件下(xia)，由于屏障泄(xie)漏或單(dan)(dan)層崩塌導致(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂質(zhi)(zhi)損失(shi)導致(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)(dan)層遲滯可(ke)以忽(hu)略不計，類似于SOPC等對照脂質(zhi)(zhi)（數(shu)據(ju)未(wei)顯示）。

離子(zi)(zi)強度(du)(du)增加(jia)對(dui)(dui)PIP2單分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)膜(mo)的(de)(de)(de)擴(kuo)展(zhan)效應(ying)。為了(le)研究離子(zi)(zi)強度(du)(du)對(dui)(dui)PIP2單分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)膜(mo)行為的(de)(de)(de)影響，在(zai)亞相(xiang)不同濃度(du)(du)的(de)(de)(de)NaCl下取(qu)了(le)π-A等溫(wen)線。在(zai)高于5 mN/m的(de)(de)(de)所(suo)有表面壓力下，添加(jia)NaCl可(ke)顯(xian)著(zhu)擴(kuo)展(zhan)單分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)膜(mo)（圖(tu)1a）。在(zai)預先形成的(de)(de)(de)PIP2單層的(de)(de)(de)亞相(xiang)中加(jia)入(ru)NaCl時也觀察(cha)到(dao)了(le)這種反應(ying)。在(zai)恒定分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)面積(ji)下，添加(jia)250 mM NaCl后(hou)，表面壓力增加(jia)，其(qi)大小與等溫(wen)線實驗中觀察(cha)到(dao)的(de)(de)(de)大小相(xiang)當，在(zai)擴(kuo)散限(xian)制時間尺度(du)(du)上（圖(tu)1a插圖(tu)）。在(zai)π）30 mN/m時，每個PIP2分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)的(de)(de)(de)面積(ji)增加(jia)了(le)13%，達(da)到(dao)82.5?2/分(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)（圖(tu)1b）。該(gai)效應(ying)的(de)(de)(de)劑(ji)量反應(ying)量化(hua)表明，該(gai)效應(ying)在(zai)約200 mM NaCl下飽和(he)，并在(zai)生(sheng)理相(xiang)關鹽(yan)濃度(du)(du)范圍內(nei)顯(xian)示(shi)出(chu)顯(xian)著(zhu)變(bian)化(hua)（圖(tu)1c）。

圖1：。NaCl對(dui)PIP2單分子(zi)膜(mo)的(de)擴張效應(ying)(ying)。（A）π-含0 mM（9）和(he)(he)250 mM NaCl（2）的(de)等溫(wen)線(xian)；（插(cha)圖）亞相注入250 mM NaCl（時間(jian)）0時，恒定面積/分子(zi)的(de)表(biao)面壓(ya)力(li)變化。（B）在pH 1.8（n）7）和(he)(he)pH 7.4（n）5）條件下，30 mN/m的(de)每個分子(zi)的(de)面積。（C）對(dui)亞相NaCl的(de)劑(ji)量反應(ying)(ying)。誤差條為(wei)平均值（n處為(wei)SE）5，除非另有(you)說明。所有(you)數據均為(wei)HEPES緩沖亞相的(de)L-R PIP2，pH 7.4（除非另有(you)說明），30°C。

為了(le)測試靜(jing)電機制（如反離子云(yun)排(pai)斥）導致單層(ceng)膨脹的(de)(de)可能性，使用與(yu)PIP2實驗相(xiang)同的(de)(de)條件(jian)，測量了(le)250 mM NaCl對另一種帶電脂質L-R PS的(de)(de)影(ying)響。PS的(de)(de)單分(fen)子膜(mo)與(yu)PIP2的(de)(de)單分(fen)子膜(mo)沒有受(shou)到(dao)相(xiang)同的(de)(de)影(ying)響，相(xiang)反，隨著亞相(xiang)離子強度(du)的(de)(de)增加，PS的(de)(de)單分(fen)子膜(mo)表現出(chu)非(fei)常輕微的(de)(de)收縮（圖2a）。

圖(tu)2：。鹽(yan)膨脹效應(ying)對PIP2的(de)(de)特異(yi)性。（A）L-R PIP2和(he)L-R PS的(de)(de)每分子面積；和(he)（B）HEPES緩沖亞相上的(de)(de)L-R PIP2、L-R PI（4）P和(he)L-R PI，pH 7.4，π）30mN/m下的(de)(de)30°C。平均值（SE，n）4。

為了(le)確定PIP2特異性膨脹(zhang)是(shi)否主(zhu)要(yao)由(you)大塊肌(ji)(ji)(ji)醇(chun)(chun)環引起，同(tong)(tong)時控制酰基(ji)鏈組成(cheng)，用磷脂酰肌(ji)(ji)(ji)醇(chun)(chun)4-磷酸(suan)（LR PI（4）P）和磷脂酰肌(ji)(ji)(ji)醇(chun)(chun)（LR PI）重復壓力面(mian)積等溫線。由(you)于這些(xie)分(fen)(fen)子(zi)是(shi)細胞中酶促PIP2生成(cheng)的(de)(de)前體，它們的(de)(de)脂肪酸(suan)組成(cheng)與(yu)(yu)PIP2相(xiang)似或相(xiang)同(tong)(tong)，只是(shi)在肌(ji)(ji)(ji)醇(chun)(chun)環上的(de)(de)磷酸(suan)取(qu)(qu)代(dai)程度不(bu)同(tong)(tong)。與(yu)(yu)PIP2一樣，兩種肌(ji)(ji)(ji)醇(chun)(chun)基(ji)脂質(zhi)均(jun)未(wei)觀(guan)察(cha)到相(xiang)變，平均(jun)分(fen)(fen)子(zi)面(mian)積隨著磷酸(suan)取(qu)(qu)代(dai)度的(de)(de)增加而增加，與(yu)(yu)之前的(de)(de)觀(guan)察(cha)結果一致。29然而，盡管單(dan)(dan)磷酸(suan)鹽PI（4）P與(yu)(yu)二磷酸(suan)鹽PIP2表(biao)現(xian)出相(xiang)同(tong)(tong)的(de)(de)趨勢，但PI和PI（4）P均(jun)未(wei)表(biao)現(xian)出對NaCl濃度增加的(de)(de)顯著擴張，表(biao)明類似但小得多的(de)(de)影(ying)響（圖2b）。這些(xie)數(shu)據表(biao)明，NaCl誘導PIP2單(dan)(dan)分(fen)(fen)子(zi)膜擴張的(de)(de)機制與(yu)(yu)其他陰離子(zi)以及其他肌(ji)(ji)(ji)醇(chun)(chun)基(ji)脂質(zhi)相(xiang)比，是(shi)PIP2特有的(de)(de)。

與其他陰離子磷脂相比，除了NaCl對(dui)PIP2的(de)(de)(de)擴張效應具有特異性外(wai)，該效應還依(yi)賴于(yu)PIP2異構體(ti)。對(dui)肌醇(chun)環（3和(he)5、4和(he)5、3和(he)4）上不(bu)同位置(zhi)被(bei)取代的(de)(de)(de)合成PIP2類(lei)似物的(de)(de)(de)分子面積進行量化表(biao)明，分子面積不(bu)僅(jin)取決于(yu)磷酸(suan)鹽(yan)的(de)(de)(de)位置(zhi)，而且(qie)NaCl誘導膨脹的(de)(de)(de)大小也受磷酸(suan)單酯在(zai)三種不(bu)同異構體(ti)中的(de)(de)(de)位置(zhi)的(de)(de)(de)影響（圖(tu)5a）。對(dui)這種膨脹的(de)(de)(de)直接比較(jiao)表(biao)明，對(dui)于(yu)PI（3,5）P2，0和(he)250 mM NaCl之(zhi)間的(de)(de)(de)差異最大(～22?），然后是PI（4,5）P2（11?2）和(he)PI（3,4）P2（5?2），并且(qie)PIP2異構體(ti)之(zhi)間的(de)(de)(de)差異在(zai)統計學上非常顯著（p<0.001）。

圖5：。亞相氯(lv)化鈉(na)膨脹效應的(de)PIP2異(yi)構(gou)體特異(yi)性。（A）HEPES緩沖亞相上的(de)DO-PIP2異(yi)構(gou)體在π）30 mN/m時(shi)的(de)每(mei)分(fen)子(zi)面積(ji)(ji)。平均值（SE，n）7。（B）250 mM NaCl和無亞相NaCl之(zhi)間(jian)DOPIP2異(yi)構(gou)體的(de)每(mei)分(fen)子(zi)面積(ji)(ji)差(cha)異(yi)。通過雙向(xiang)ANOVA測量，NaCl效應的(de)異(yi)構(gou)體依賴性顯(xian)著達到p）0.0001。（C）PIP2分(fen)子(zi)間(jian)相互作用的(de)概念動畫。在沒(mei)有潮向(xiang)性試劑(ji)（綠色(se)橢圓）的(de)情況下，PIP2分(fen)子(zi)形(xing)成(cheng)水介(jie)導的(de)氫鍵網絡。當(dang)添加(jia)潮向(xiang)性聚合物時(shi)，網絡被破(po)壞，帶電(dian)磷(lin)酸(suan)鹽之(zhi)間(jian)的(de)靜電(dian)排斥導致單層的(de)膨脹。

不(bu)同(tong)(tong)反離子(zi)(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)影(ying)響。為了(le)確定單(dan)價鹽(yan)對PIP2單(dan)分(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)膜的(de)(de)(de)擴張效(xiao)應的(de)(de)(de)離子(zi)(zi)(zi)(zi)特(te)異性(xing)，測試了(le)其(qi)他陽(yang)(yang)離子(zi)(zi)(zi)(zi)反離子(zi)(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)效(xiao)應。在(zai)250 mM時(shi)，所有測試的(de)(de)(de)單(dan)價陽(yang)(yang)離子(zi)(zi)(zi)(zi)（Na+、K+、Li+、Cs+）顯示出類似(si)的(de)(de)(de)、統計上顯著的(de)(de)(de)PIP2單(dan)分(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)膜擴展，其(qi)影(ying)響程度與(yu)離子(zi)(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)電(dian)荷(he)密度直接相關，即(ji)Li+>Na+>K+≈Cs+（圖3a，p）0.15-0.3，因為數據集有限，離子(zi)(zi)(zi)(zi)之間(jian)的(de)(de)(de)差異）。這里觀察到的(de)(de)(de)電(dian)荷(he)密度依賴性(xing)不(bu)同(tong)(tong)于鹽(yan)誘導(dao)的(de)(de)(de)低電(dian)荷(he)陰(yin)離子(zi)(zi)(zi)(zi)磷脂(zhi)單(dan)分(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)膜的(de)(de)(de)膨(peng)脹，在(zai)鹽(yan)誘導(dao)下，沒(mei)有觀察到陽(yang)(yang)離子(zi)(zi)(zi)(zi)依賴性(xing)或相反的(de)(de)(de)趨勢。30與(yu)PG相比，不(bu)同(tong)(tong)陽(yang)(yang)離子(zi)(zi)(zi)(zi)引(yin)起的(de)(de)(de)PIP2膨(peng)脹的(de)(de)(de)幅度30似(si)乎與(yu)描述離子(zi)(zi)(zi)(zi)潮向性(xing)的(de)(de)(de)Hofmeister級數直接相關（參考文獻31）。這一結果表明，除(chu)了(le)對頭(tou)基質子(zi)(zi)(zi)(zi)化(hua)產(chan)生影(ying)響外，這些離子(zi)(zi)(zi)(zi)還可能破壞單(dan)分(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)層內(nei)多分(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)水介(jie)導(dao)氫鍵網絡的(de)(de)(de)結構(gou)。

圖(tu)3：。各種(zhong)反(fan)離子(zi)的影響(xiang)。（A）用250 mM鹽緩沖HEPES亞(ya)相上(shang)的L-R PIP2在π）30 mN/m處的每分子(zi)面積(ji)；平(ping)均(jun)值(zhi)（SE，n）5。（B）π-L-R PIP2 HEPES緩沖亞(ya)相的面積(ji)等溫線，pH 7.4，30°C（實線），相同條件加250 mM CaCl2（虛線）；（插圖(tu)）250 mM CaCl2和MgCl2影響(xiang)的量化；平(ping)均(jun)值(zhi)（SE，n）4。

與(yu)單價鹽(yan)相比，二價反(fan)離子對PIP2的(de)(de)影響非常不同。CaCl2和(he)(he)MgCl2對純PIP2單分子膜(mo)都有很大的(de)(de)冷凝作用（圖3b）。圖3b中的(de)(de)代表性等溫線突出(chu)了這(zhe)些(xie)差異，包括π）30 mN/m和(he)(he)較低表面(mian)壓力(li)下每(mei)PIP2的(de)(de)面(mian)積(ji)。插(cha)圖顯示(shi)了二價陽離子凝聚(ju)效應的(de)(de)量化，并表明含有250 mM Ca2+和(he)(he)Mg2+的(de)(de)PIP2單分子膜(mo)分別比對照(zhao)壓縮了15%和(he)(he)9%。這(zhe)些(xie)結(jie)(jie)果(guo)與(yu)已(yi)知的(de)(de)Ca2+作為(wei)PIP2交聯劑的(de)(de)能(neng)力(li)一致，Ca2+以高親和(he)(he)力(li)結(jie)(jie)合和(he)(he)脫水多種磷酸鹽(yan)，32,33中和(he)(he)其電荷(he)，橋聯頭(tou)基(ji)以形成(cheng)緊密(mi)凝聚(ju)的(de)(de)單分子膜(mo)，34即使在(zai)低表面(mian)壓力(li)下也(ye)是如此。

非離(li)子液晶和溫度的(de)(de)膨(peng)脹效(xiao)應。為了驗證單(dan)價鹽(yan)破壞PIP2頭基之間(jian)有(you)吸引力的(de)(de)氫鍵相互作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)的(de)(de)假(jia)設，部(bu)分(fen)克服了高(gao)頭基電荷密度預期的(de)(de)靜電排斥作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)，測試了幾種(zhong)非離(li)子超嗜性(xing)因子破壞這(zhe)(zhe)些假(jia)定網絡和誘導單(dan)層膨(peng)脹的(de)(de)能力。尿素是(shi)(shi)一(yi)種(zhong)因其潮向性(xing)而常用(yong)(yong)的(de)(de)蛋白質變性(xing)劑，海藻糖是(shi)(shi)一(yi)種(zhong)非還(huan)原性(xing)葡(pu)萄(tao)糖二聚體(ti)，因其破壞水結構的(de)(de)能力而具有(you)低溫保(bao)護(hu)特性(xing)，對(dui)(dui)其對(dui)(dui)PIP2單(dan)層的(de)(de)影響進行了測試。與通過氫鍵的(de)(de)吸引相互作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)相一(yi)致，兩種(zhong)非離(li)子超取向對(dui)(dui)單(dan)分(fen)子膜都有(you)很(hen)強的(de)(de)膨(peng)脹效(xiao)應。在π）30 mN/m時，5 m尿素使每個PIP2分(fen)子的(de)(de)面積增加了近25%，達到(dao)90.9?2/分(fen)子，這(zhe)(zhe)是(shi)(shi)在這(zhe)(zhe)些實驗中所采(cai)用(yong)(yong)的(de)(de)任何條件下觀察到(dao)的(de)(de)最高(gao)值（圖4b）。同樣，5 mM海藻糖顯(xian)著增加PIP2單(dan)層的(de)(de)面積9%。這(zhe)(zhe)些作(zuo)(zuo)用(yong)(yong)對(dui)(dui)PIP2有(you)特異性(xing)，因為兩種(zhong)處理對(dui)(dui)PI的(de)(de)單(dan)層都沒有(you)顯(xian)著影響。

 圖4：。水介導分子(zi)間氫(qing)鍵的(de)(de)證據。HEPES緩沖亞相上的(de)(de)L-R PIP2和L-R PI在π）30 mN/m時的(de)(de)每分子(zi)面積，pH 7.4（A）存在5 mM海藻糖和5 m尿素(su)，（B）作(zuo)為亞相（O）PIP2溫度的(de)(de)函數；0）PI）。

最后，為(wei)(wei)了(le)驗證氫(qing)鍵假(jia)設，對(dui)PIP2單(dan)分(fen)(fen)(fen)子(zi)膜(mo)的(de)(de)溫(wen)(wen)度(du)(du)依賴性行為(wei)(wei)進行了(le)測試。隨著亞(ya)相(xiang)(xiang)溫(wen)(wen)度(du)(du)從(cong)34°C降(jiang)至17°C，這(zhe)些(xie)單(dan)層(ceng)顯示(shi)出(chu)非常(chang)顯著的(de)(de)收縮(suo)，每個分(fen)(fen)(fen)子(zi)的(de)(de)面積減少了(le)近50%（圖4a）。相(xiang)(xiang)反，PI的(de)(de)單(dan)層(ceng)僅(jin)收縮(suo)～在(zai)相(xiang)(xiang)同溫(wen)(wen)度(du)(du)范圍內為(wei)(wei)10%，與kBT壓(ya)力的(de)(de)簡單(dan)縮(suo)放一致(zhi)。雖然由于脂質(zhi)動能的(de)(de)降(jiang)低(di)，預計會出(chu)現(xian)一些(xie)收縮(suo)，但(dan)PIP2的(de)(de)50%差異強(qiang)烈表明了(le)另一種機(ji)制，如子(zi)相(xiang)(xiang)的(de)(de)熱能增加會破壞氫(qing)鍵網絡。純PIP2在(zai)亞(ya)相(xiang)(xiang)溫(wen)(wen)度(du)(du)以下不能形成壓(ya)縮(suo)單(dan)分(fen)(fen)(fen)子(zi)膜(mo)～15°C，相(xiang)(xiang)反，在(zai)相(xiang)(xiang)對(dui)較低(di)的(de)(de)表面壓(ya)力下（小于10 mN/m；數(shu)據(ju)未顯示(shi)）出(chu)現(xian)坍塌。這(zhe)一結(jie)(jie)果可(ke)(ke)能與理解溫(wen)(wen)度(du)(du)誘導的(de)(de)細胞結(jie)(jie)構變(bian)化有(you)關(guan)，例如血小板(ban)的(de)(de)冷激活，在(zai)此過(guo)程(cheng)中(zhong)，質(zhi)膜(mo)上PIP2組織的(de)(de)變(bian)化觸(chu)發肌動蛋(dan)白(bai)組裝。35 PIP2在(zai)低(di)溫(wen)(wen)下無(wu)(wu)法保(bao)持平面狀態也可(ke)(ke)能與在(zai)4°C下溶(rong)解的(de)(de)細胞膜(mo)耐去污劑部(bu)分(fen)(fen)(fen)中(zhong)存在(zai)PIP2有(you)關(guan)，14通常(chang)與脂筏有(you)關(guan)。因此，從(cong)低(di)于15°C的(de)(de)結(jie)(jie)果中(zhong)無(wu)(wu)法推斷在(zai)較高(gao)溫(wen)(wen)度(du)(du)下富含膽固(gu)醇(chun)的(de)(de)結(jie)(jie)構域中(zhong)存在(zai)PIP2。

討論

多(duo)磷酸肌醇是一種重要的(de)(de)(de)(de)(de)信(xin)號中(zhong)間產物(wu)，但(dan)人們(men)對(dui)產生或降解(jie)這些脂質的(de)(de)(de)(de)(de)酶的(de)(de)(de)(de)(de)遺傳調節(jie)和表(biao)達的(de)(de)(de)(de)(de)了解(jie)要比決定(ding)這些脂質在(zai)質膜內(nei)分布(bu)或在(zai)不同(tong)細(xi)胞間轉運的(de)(de)(de)(de)(de)物(wu)理化學的(de)(de)(de)(de)(de)了解(jie)多(duo)得多(duo)。由于它們(men)帶有(you)很大(da)的(de)(de)(de)(de)(de)負電(dian)荷，人們(men)似乎(hu)普遍認(ren)為，這些脂質在(zai)雙層平面內(nei)僅表(biao)現出相互排(pai)斥的(de)(de)(de)(de)(de)相互作用(yong)，除非它們(men)與特定(ding)的(de)(de)(de)(de)(de)蛋白質絡合，否(fou)則會(hui)使它們(men)分散。20,23,36一些證(zheng)據(ju)表(biao)明，PPI在(zai)產生洗滌劑不溶性(xing)脂質組分的(de)(de)(de)(de)(de)條件下被(bei)強烈(lie)隔(ge)離（通(tong)常被(bei)視為PPI定(ding)位于脂筏(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)證(zheng)據(ju)14），而使用(yong)熒光能量(liang)轉移方法的(de)(de)(de)(de)(de)研究(jiu)提(ti)供了氫鍵(jian)可能穩定(ding)富含PPI的(de)(de)(de)(de)(de)簇合物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)證(zheng)據(ju)。24,25在(zai)這種情(qing)況(kuang)下，目前(qian)的(de)(de)(de)(de)(de)結果(guo)提(ti)供了PPI之間靜電(dian)相互作用(yong)大(da)小的(de)(de)(de)(de)(de)定(ding)量(liang)估計，并表(biao)明由氫鍵(jian)介導(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)吸(xi)引相互作用(yong)顯著抵消了靜電(dian)排(pai)斥。

用(yong)純靜(jing)電(dian)機制(zhi)很(hen)好地解釋了PIP2的壓(ya)力-面(mian)積等溫線的一(yi)(yi)個特征是單(dan)價(jia)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)對(dui)表面(mian)壓(ya)力的一(yi)(yi)般影響。盡管(guan)單(dan)價(jia)鹽(yan)在(zai)PIP2單(dan)分(fen)子(zi)(zi)(zi)膜(mo)亞(ya)相(xiang)中的膨脹效(xiao)(xiao)應(ying)(ying)可能與(yu)頭(tou)基之間的靜(jing)電(dian)排斥作(zuo)用(yong)不(bu)一(yi)(yi)致(zhi)（亞(ya)相(xiang)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)可能會屏蔽(bi)陰離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)頭(tou)基，并允許更緊密的填充37,38），但(dan)亞(ya)相(xiang)陽(yang)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)導致(zhi)的單(dan)分(fen)子(zi)(zi)(zi)膜(mo)膨脹是由(you)于磷酸(suan)單(dan)酯電(dian)離(li)(li)(li)電(dian)位對(dui)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)強度的依賴(lai)性，先前顯示磷脂(zhi)酸(suan)單(dan)層。39這(zhe)種(zhong)效(xiao)(xiao)應(ying)(ying)在(zai)調節荷電(dian)單(dan)分(fen)子(zi)(zi)(zi)膜(mo)的凝膠-液體轉變(bian)溫度方面(mian)很(hen)重要(yao)，40盡管(guan)亞(ya)相(xiang)鹽(yan)與(yu)其他(ta)陰離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)脂(zhi)質(zhi)的膨脹效(xiao)(xiao)應(ying)(ying)測量(liang)值(zhi)遠(yuan)小于此處(chu)觀察到(dao)的PIP2膨脹效(xiao)(xiao)應(ying)(ying)。30

最近(jin)，通(tong)(tong)過將(jiang)系統(tong)建(jian)模為可電(dian)(dian)(dian)離(li)(li)基(ji)團的(de)均勻(yun)分(fen)(fen)(fen)布平面(mian)，確定了純(chun)靜電(dian)(dian)(dian)對PIP2單分(fen)(fen)(fen)子(zi)膜表面(mian)壓(ya)(ya)(ya)力的(de)貢獻，其電(dian)(dian)(dian)荷密度(du)(du)(du)是可電(dian)(dian)(dian)離(li)(li)基(ji)團pKa和(he)亞相(xiang)(xiang)溶液(ye)離(li)(li)子(zi)強度(du)(du)(du)的(de)函數(shu)。41通(tong)(tong)過區分(fen)(fen)(fen)熱力學勢與表面(mian)積的(de)關系計(ji)(ji)算出的(de)靜電(dian)(dian)(dian)排(pai)斥(chi)引起的(de)表面(mian)壓(ya)(ya)(ya)力與一(yi)些觀(guan)察到(dao)的(de)實(shi)(shi)(shi)驗結果定性(xing)一(yi)致(zhi)。在(zai)中(zhong)性(xing)pH下(xia)(xia)(xia)觀(guan)察到(dao)的(de)膨(peng)脹(zhang)(zhang)單分(fen)(fen)(fen)子(zi)膜（高達(da)150?2/分(fen)(fen)(fen)子(zi)）的(de)高壓(ya)(ya)(ya)可以(yi)用高電(dian)(dian)(dian)荷頭(tou)基(ji)的(de)排(pai)斥(chi)作用來(lai)解(jie)釋。此外，中(zhong)性(xing)pH下(xia)(xia)(xia)的(de)靜電(dian)(dian)(dian)模型(xing)證實(shi)(shi)(shi)了具有低(di)離(li)(li)子(zi)強度(du)(du)(du)和(he)高離(li)(li)子(zi)強度(du)(du)(du)的(de)等溫線之(zhi)間的(de)交叉以(yi)及由于高離(li)(li)子(zi)強度(du)(du)(du)導致(zhi)的(de)單層膨(peng)脹(zhang)(zhang)（參考文獻41中(zhong)的(de)圖(tu)1a和(he)圖(tu)4b）。然而，許多實(shi)(shi)(shi)驗觀(guan)察到(dao)的(de)結果與純(chun)靜電(dian)(dian)(dian)處理不兼容(rong)。具體(ti)而言，不同單價離(li)(li)子(zi)的(de)不同影(ying)響不能完全通(tong)(tong)過亞相(xiang)(xiang)離(li)(li)子(zi)強度(du)(du)(du)的(de)變化來(lai)解(jie)釋。NaCl誘導的(de)單層擴張的(de)PIP2異構體(ti)特異性(xing)以(yi)及不帶電(dian)(dian)(dian)的(de)潮向性(xing)和(he)溫度(du)(du)(du)的(de)影(ying)響也表明了比表觀(guan)頭(tou)基(ji)pKa的(de)嚴格靜電(dian)(dian)(dian)亞相(xiang)(xiang)離(li)(li)子(zi)強度(du)(du)(du)調制(zhi)更(geng)復雜(za)的(de)分(fen)(fen)(fen)子(zi)機制(zhi)。此外，pH值(zhi)(zhi)為1.8時亞相(xiang)(xiang)鹽的(de)膨(peng)脹(zhang)(zhang)效應(ying)（圖(tu)1b）與預(yu)(yu)測(ce)在(zai)所有磷酸(suan)單酯質子(zi)化的(de)條件(jian)下(xia)(xia)(xia)沒有靜電(dian)(dian)(dian)效應(ying)的(de)模型(xing)不一(yi)致(zhi)（參考文獻41中(zhong)的(de)圖(tu)4f）。最后，在(zai)幾乎所有情況下(xia)(xia)(xia)，實(shi)(shi)(shi)驗測(ce)定的(de)PIP2表面(mian)壓(ya)(ya)(ya)力明顯低(di)于純(chun)靜電(dian)(dian)(dian)效應(ying)保守估計(ji)(ji)的(de)預(yu)(yu)測(ce)值(zhi)(zhi)。

上述實(shi)驗結果突出了吸(xi)引(yin)(yin)力相(xiang)互(hu)作(zuo)用的(de)(de)重(zhong)要性(xing)，這(zhe)種(zhong)相(xiang)互(hu)作(zuo)用可(ke)(ke)(ke)能是由氫(qing)(qing)鍵(jian)(jian)介(jie)導的(de)(de)，可(ke)(ke)(ke)以顯著對抗平面(mian)(mian)系(xi)(xi)統中(zhong)(zhong)(zhong)PIP2脂質之(zhi)間的(de)(de)排(pai)斥靜(jing)電相(xiang)互(hu)作(zuo)用。這(zhe)些有吸(xi)引(yin)(yin)力的(de)(de)相(xiang)互(hu)作(zuo)用可(ke)(ke)(ke)能會被一些朝潮性(xing)因(yin)(yin)素(su)(su)破(po)壞(huai)(huai)(huai)，如單(dan)價離(li)子、海(hai)藻糖或(huo)尿(niao)素(su)(su)。這(zhe)些發現總(zong)結在(zai)(zai)圖(tu)5c所示的(de)(de)定性(xing)模(mo)(mo)型中(zhong)(zhong)(zhong)。在(zai)(zai)沒有干擾劑的(de)(de)情況下，幾(ji)個(ge)PIP2分子通(tong)過水(shui)介(jie)導的(de)(de)氫(qing)(qing)鍵(jian)(jian)網絡相(xiang)互(hu)作(zuo)用。當存(cun)在(zai)(zai)破(po)壞(huai)(huai)(huai)水(shui)-PIP2相(xiang)互(hu)作(zuo)用的(de)(de)離(li)子因(yin)(yin)素(su)(su)或(huo)非離(li)子超取(qu)向物時，氫(qing)(qing)鍵(jian)(jian)被破(po)壞(huai)(huai)(huai)，靜(jing)電排(pai)斥導致分子面(mian)(mian)積增加。該(gai)模(mo)(mo)型得(de)到了單(dan)價陽(yang)離(li)子對純PIP2單(dan)分子膜擴展效應的(de)(de)大(da)小以及尿(niao)素(su)(su)和(he)海(hai)藻糖（強非離(li)子向潮性(xing)）的(de)(de)影(ying)響(xiang)的(de)(de)支持。建議(yi)的(de)(de)氫(qing)(qing)鍵(jian)(jian)狀(zhuang)態和(he)超臨界(jie)膨脹狀(zhuang)態之(zhi)間的(de)(de)計算能量差（對于(yu)250 mM LiCl：?面(mian)(mian)積）17.8?2/分子（35 mN/m時）～6 kJ/mol）與每個(ge)PIP2分子約一個(ge)氫(qing)(qing)鍵(jian)(jian)的(de)(de)損失相(xiang)當。這(zhe)種(zhong)能量與PIP2和(he)MARCKS之(zhi)間的(de)(de)多價相(xiang)互(hu)作(zuo)用能具(ju)有相(xiang)同的(de)(de)尺度(～16千(qian)焦(jiao)/摩爾）。23混(hun)合脂質系(xi)(xi)統中(zhong)(zhong)(zhong)PIP2頭基之(zhi)間存(cun)在(zai)(zai)分子間氫(qing)(qing)鍵(jian)(jian)的(de)(de)可(ke)(ke)(ke)能性(xing)已在(zai)(zai)實(shi)驗24,25和(he)模(mo)(mo)擬42中(zhong)(zhong)(zhong)得(de)到證實(shi)，本文提供(gong)的(de)(de)數據(ju)通(tong)過實(shi)驗證實(shi)了這(zhe)種(zhong)可(ke)(ke)(ke)能性(xing)，實(shi)驗表明氫(qing)(qing)鍵(jian)(jian)是PIP2分子間相(xiang)互(hu)作(zuo)用的(de)(de)一個(ge)重(zhong)要因(yin)(yin)素(su)(su)。

溫(wen)(wen)(wen)度對PIP2單(dan)分(fen)(fen)子膜的(de)影(ying)響也表(biao)明這些(xie)脂質之間存在(zai)重要的(de)非靜電相互作(zuo)用。隨著溫(wen)(wen)(wen)度的(de)降(jiang)低(di)，表(biao)面壓力的(de)顯著下(xia)降(jiang)遠遠大于其他帶(dai)電液相脂質的(de)下(xia)降(jiang)，并且不簡單(dan)地(di)與(yu)熱能成比例。事實上，純PIP2單(dan)分(fen)(fen)子膜在(zai)室溫(wen)(wen)(wen)下(xia)的(de)穩定(ding)性明顯低(di)于37°C，并且不能在(zai)15°C以下(xia)形成。PIP2單(dan)分(fen)(fen)子膜在(zai)低(di)溫(wen)(wen)(wen)下(xia)的(de)崩塌可能與(yu)假設的(de)PPI在(zai)低(di)溫(wen)(wen)(wen)下(xia)聚集(ji)有關，被認為會觸發(fa)血小(xiao)板的(de)冷激活(huo)和可能的(de)其他生物功能。35

對(dui)于(yu)觀(guan)察到的(de)亞相(xiang)鹽(yan)(yan)效應(ying)，靜(jing)電(dian)學和(he)氫鍵的(de)另一種解釋是，單價鹽(yan)(yan)嵌入陰離(li)子(zi)頭(tou)基平面，在(zai)(zai)磷酸鹽(yan)(yan)和(he)陽離(li)子(zi)之間(jian)形(xing)成(cheng)網絡晶格。這一解釋似乎不太(tai)可(ke)能(neng)，因為膨脹(zhang)最大(da)的(de)是最小(xiao)、最正電(dian)的(de)離(li)子(zi)（Li+），而隨著離(li)子(zi)半徑的(de)增大(da)而減小(xiao)（圖(tu)3a）。此外，盡管在(zai)(zai)沒(mei)有鹽(yan)(yan)的(de)情(qing)況下(xia)形(xing)成(cheng)波(bo)紋相(xiang)可(ke)以產生更壓(ya)縮(suo)的(de)單層，但沒(mei)有通過任何(he)等溫線觀(guan)察到從(cong)液(ye)相(xiang)到波(bo)紋相(xiang)的(de)相(xiang)變（圖(tu)1a）。此外，波(bo)紋相(xiang)僅可(ke)能(neng)在(zai)(zai)高表面壓(ya)力(li)下(xia)形(xing)成(cheng)，而在(zai)(zai)低至(zhi)5 mN/m的(de)壓(ya)力(li)下(xia)，高鹽(yan)(yan)和(he)低鹽(yan)(yan)狀態(tai)之間(jian)的(de)差異很明(ming)顯（圖(tu)1a）。

有兩(liang)條證(zheng)據表明(ming)水(shui)在維持這(zhe)種網絡中的(de)(de)(de)(de)重要性，而不是相鄰PIP2分(fen)子(zi)之間(jian)的(de)(de)(de)(de)直接(jie)氫鍵(jian)。預計(ji)不會與磷酸(suan)基團(tuan)相互作用的(de)(de)(de)(de)非(fei)離子(zi)溶質尿素(su)和海藻糖(tang)對PIP2單(dan)分(fen)子(zi)膜具有強烈的(de)(de)(de)(de)擴張效應，這(zhe)可能(neng)是由于它(ta)們(men)破壞(huai)了水(shui)結構并隨(sui)后(hou)干擾了氫鍵(jian)網絡（圖4a）。其(qi)次(ci)，二(er)價陽離子(zi)（Ca2+和Mg2+）誘導的(de)(de)(de)(de)PIP2每個(ge)分(fen)子(zi)面積(ji)的(de)(de)(de)(de)顯著減少證(zheng)實了它(ta)們(men)能(neng)夠橋接(jie)相鄰脂質，從而導致界面脫水(shui)，并表明(ming)盡(jin)管PIP2單(dan)分(fen)子(zi)膜通過氫鍵(jian)能(neng)力保持壓(ya)縮狀態，它(ta)們(men)不像被二(er)價陽離子(zi)直接(jie)交聯時那(nei)樣被緊密壓(ya)縮（圖3b）。

許(xu)多(duo)實(shi)驗表(biao)明，PIP2的(de)許(xu)多(duo)細胞結(jie)合(he)(he)伙伴至少有(you)兩種不同的(de)相(xiang)互作用模(mo)式。一(yi)些蛋(dan)(dan)(dan)白質（例(li)(li)如，含(han)有(you)PH結(jie)構域的(de)蛋(dan)(dan)(dan)白質）對單(dan)個(ge)PIP2分(fen)子(zi)(zi)有(you)一(yi)個(ge)特(te)定的(de)結(jie)合(he)(he)位點，43–45，而其他(ta)蛋(dan)(dan)(dan)白質則含(han)有(you)非結(jie)構化的(de)多(duo)元酸結(jie)構域，被(bei)認為可(ke)(ke)以通(tong)過非特(te)異性(xing)靜電(dian)吸引同時結(jie)合(he)(he)多(duo)個(ge)PIP2分(fen)子(zi)(zi)（例(li)(li)如，MARCKS23,46）。考慮到細胞可(ke)(ke)能通(tong)過影響氫鍵和(he)靜電(dian)排斥(chi)之(zhi)間的(de)平(ping)衡來調節PIP2介導(dao)的(de)信號(hao)傳導(dao)，從而調節可(ke)(ke)用于(yu)單(dan)個(ge)脂質結(jie)合(he)(he)蛋(dan)(dan)(dan)白域的(de)PIP2池與可(ke)(ke)用于(yu)結(jie)合(he)(he)多(duo)分(fen)子(zi)(zi)組裝(zhuang)的(de)PIP2池，這(zhe)似乎(hu)是合(he)(he)理的(de)。

確認(ren)。這(zhe)項工(gong)作得到了MRSEC第05-20020號贈款(kuan)（I.L.和(he)P.A.J.）和(he)富布賴特基金會（A.C.）的資助。