膜(mo)蛋白是一種位(wei)于(yu)細胞(bao)膜(mo)上的蛋白，主要分為外周膜(mo)蛋白和跨膜(mo)蛋白兩大(da)類(lei)。膜(mo)蛋白具(ju)有重要的生物(wu)功能，如控制能量轉(zhuan)換(huan)、參(can)與信號轉(zhuan)導、控制物(wu)質運輸(shu)、維持細胞(bao)和組織結構等，因此(ci)膜(mo)蛋白一直是研究(jiu)熱門，是當前近70%的藥(yao)物(wu)靶(ba)標。

想要研究更具體膜蛋白(bai)結構或者功能(neng)特性(xing)，我們首先要提(ti)取純化相應的膜蛋白(bai)。接下來以一篇經典Nature文章為例，解析如(ru)何提(ti)取純化膜蛋白(bai)。

2019年Nature文章：人(ren)的T cell receptor–CD3復(fu)合體結構(gou)研(yan)究

純化(hua)思路：

（1）重組蛋白的構建：

以哺乳(ru)細(xi)胞HEK293F為表達宿主(zhu)，在C末(mo)端(duan)依次(ci)加了Strep和(he)His標簽。

目的基(ji)因：TCRα，TCRβ（pCAG)+CD3γ、δ、ε、ζ（pcDNA3,4）。

（2）重(zhong)組蛋白(bai)的誘導(dao)表達：

在(zai)37℃、含(han)有5%CO2條件下，120 rpm培養60 h。

（3）細胞(bao)膜結構(gou)的(de)制備和溶解：

通過離心收集(ji)細(xi)胞，然后(hou)勻漿破碎。

細胞膜結構組份的(de)收集：用25 mM HEPES，pH 7.5,1 M NaCl緩沖溶(rong)液重懸(xuan)，加入1mM PMSF，100,000g超(chao)速離心30 min收集細胞膜結構組份。

細胞膜(mo)結構的溶(rong)(rong)解：用25 mM HEPES，pH 7.5,150 mMNaCl，1%DDM，0.2%cholesteryl hemisuccinate tris salt,1 mM PMSF,4℃條件下溶(rong)(rong)解2 h。

40,000g離心30 min，收(shou)集上清，即(ji)為可(ke)溶(rong)的(de)膜蛋白粗溶(rong)液。

（4）親(qin)和層析純化：

本文作者(zhe)用StrepTactin填料(liao)進行純化。

結合條件：4℃結合3 h；

 Wash buffer:25 mM HEPES，pH 7.5,300 mM NaCl,0.06%digitonin;

Elution buffer:25 mM HEPES,pH 7.5,150 mM NaCl,0.06%digitonin+4 mM desthiobiotin

圖1親和層析后，各個亞基的SDS-PAGE圖

（5）膜蛋白復合體交聯

蛋白(bai)質濃縮后用0.1%(v/v)的戊(wu)二醛(quan)交聯40min，得到膜蛋白(bai)復合體。

（6）凝膠過濾分(fen)子篩層析(xi)：

用Superose 6 increase 10/300,buffer為25 mM HEPES,pH 7.5,150 mM NaCl,0.06%digitonin

圖2 TCR-CD3復合體SDS-PAGE圖

膜蛋(dan)白復合體TCR-CD3交聯后進行凝膠(jiao)過濾分子(zi)篩層析(xi)，進行SDS-PAGE實(shi)驗，發現得到比較純(chun)的復合體。

（7）TCR-CD3結構(gou)分析

通過冷(leng)凍電鏡分析，TCR–CD3復合物(wu)的最終原(yuan)子模(mo)型包含(han)全長(chang)TCRαβ的亞基，完(wan)整的ECD和跨膜螺旋CD3γε，CD3δε和CD3ζζ

圖3 TCR–CD3復合體結構圖

看(kan)完大佬的實驗框架，是(shi)不(bu)是(shi)頓時對自己的實驗也有了一(yi)些思路？

總結一下，膜蛋(dan)白的一般研究流程(cheng)：

藍色(se)背景分(fen)別是表達(da)系統與去垢劑的(de)選擇，是整個流程中至(zhi)關(guan)重要的(de)步驟。

膜(mo)蛋白的(de)表(biao)達(da)系統：原核表(biao)達(da)（大(da)腸桿(gan)菌(jun)(jun)、紅(hong)桿(gan)菌(jun)(jun)屬）、哺乳細胞(bao)（HEK293F）、酵母表(biao)達(da)、昆蟲(chong)細胞(bao)表(biao)達(da)。不(bu)同的(de)表(biao)達(da)系統的(de)優缺點見下圖。

去(qu)垢(gou)(gou)劑的選擇：去(qu)垢(gou)(gou)劑別名表面活性(xing)劑、乳化劑、肥(fei)皂等等，分(fen)為(wei)(wei)離(li)子(zi)型(xing)、非離(li)子(zi)型(xing)和兩性(xing)離(li)子(zi)型(xing)三類。去(qu)垢(gou)(gou)劑是同時(shi)具有親水性(xing)和疏水性(xing)基團的雙極性(xing)分(fen)子(zi)，能夠使磷脂雙分(fen)子(zi)層解(jie)體并釋放膜(mo)蛋白，并且為(wei)(wei)去(qu)膜(mo)狀態下(xia)的膜(mo)蛋白提供穩定的疏水環境。去(qu)垢(gou)(gou)劑也需(xu)要(yao)篩(shai)選合適的種類和濃度，各(ge)自優缺(que)點(dian)見(jian)下(xia)圖(tu)。

蛋(dan)白(bai)純化：使用親(qin)和(he)+凝膠過(guo)濾（分子(zi)(zi)篩）即可完(wan)成膜(mo)蛋(dan)白(bai)的純化流程(cheng)。膜(mo)蛋(dan)白(bai)純化由(you)于含(han)有去(qu)垢劑的存在，離子(zi)(zi)交換不作為(wei)第(di)一(yi)選擇。

操作TIPS

一、膜蛋白分(fen)離(li)

1、膜蛋(dan)白(bai)(bai)的內(nei)源表(biao)(biao)達(da)(da)通常來(lai)說是比較低的，如(ru)(ru)果要提高產量可以(yi)(yi)通過重組膜蛋(dan)白(bai)(bai)的過表(biao)(biao)達(da)(da)，可以(yi)(yi)選擇(ze)大腸桿菌，酵(jiao)母，哺乳動(dong)物或者無(wu)細胞表(biao)(biao)達(da)(da)體系。然而(er)，外源表(biao)(biao)達(da)(da)的翻譯(yi)后修(xiu)飾(shi)例如(ru)(ru)糖基化，磷酸(suan)化和乙酰化和天然蛋(dan)白(bai)(bai)的不同可能會導致重組蛋(dan)白(bai)(bai)的某些活性下降（原核表(biao)(biao)達(da)(da)沒有翻譯(yi)后修(xiu)飾(shi)系統），可以(yi)(yi)考慮通過對組成修(xiu)飾(shi)的氨基酸(suan)進行(xing)位點(dian)突變來(lai)改(gai)善。

2、跨膜(mo)蛋(dan)白(bai)具有較高的(de)(de)疏水性，經常需要高濃度的(de)(de)去(qu)垢(gou)劑(ji)來幫助溶(rong)解(jie)。此外，膜(mo)蛋(dan)白(bai)也(ye)(ye)溶(rong)液形(xing)成聚集(ji)體，甚至(zhi)是在去(qu)垢(gou)劑(ji)存(cun)在的(de)(de)情(qing)況下(xia)(xia)，會影(ying)響(xiang)下(xia)(xia)游(you)純化效(xiao)率。去(qu)垢(gou)劑(ji)的(de)(de)選擇(ze)也(ye)(ye)會影(ying)響(xiang)下(xia)(xia)游(you)純化步(bu)驟(zou)的(de)(de)效(xiao)率。例如，在帶有電(dian)荷的(de)(de)去(qu)垢(gou)劑(ji)存(cun)在的(de)(de)情(qing)況下(xia)(xia)不適合使(shi)用離子交換層(ceng)(ceng)析；而在有去(qu)垢(gou)劑(ji)的(de)(de)情(qing)況下(xia)(xia)也(ye)(ye)不適合使(shi)用疏水層(ceng)(ceng)析。

3、一旦溶解之(zhi)后，膜蛋白(bai)(bai)經(jing)常會變得更易(yi)于被蛋白(bai)(bai)酶降解。因此添加(jia)蛋白(bai)(bai)酶抑(yi)制劑例如EDTA和PMSF是(shi)很重要的（如果下游使用普通Ni柱純化，不能使用EDTA）。

二、外周膜蛋白提取

外周膜(mo)(mo)(mo)蛋(dan)白(bai)(bai)可以使(shi)用(yong)(yong)相對溫和的(de)技術來(lai)分離，破壞外周膜(mo)(mo)(mo)蛋(dan)白(bai)(bai)和細胞膜(mo)(mo)(mo)之(zhi)(zhi)間(jian)的(de)靜(jing)電作(zuo)用(yong)(yong)或者氫鍵(jian)，而不(bu)破壞整(zheng)個細胞膜(mo)(mo)(mo)。通常使(shi)用(yong)(yong)的(de)試劑參見(jian)表一。使(shi)用(yong)(yong)含有(you)高鹽離子濃度的(de)緩(huan)沖液進行(xing)提(ti)取(qu)很有(you)用(yong)(yong)因(yin)為他們會降低膜(mo)(mo)(mo)蛋(dan)白(bai)(bai)和帶有(you)電荷的(de)脂質之(zhi)(zhi)間(jian)的(de)靜(jing)電相互作(zuo)用(yong)(yong)。

在(zai)提取(qu)緩(huan)沖液(ye)提取(qu)10-30min后，剩下(xia)的膜雙層結構和相關的膜內蛋白可以被離(li)心(xin)分離(li)（30-60min，100,000xg），釋(shi)放的外周膜蛋白存在(zai)于上(shang)清液(ye)中。

三(san)、跨膜蛋白(bai)的提取

為了溶(rong)解(jie)得(de)到跨(kua)膜蛋白，破壞膜雙(shuang)層結(jie)(jie)構(gou)是(shi)必要的(de)(de)。通(tong)常(chang)使用去垢(gou)劑(ji)(ji)的(de)(de)方法。去垢(gou)劑(ji)(ji)是(shi)一(yi)種兩性分(fen)子，同時包(bao)含疏(shu)水和親水的(de)(de)部(bu)分(fen)，并且在水中會(hui)形成膠束。膠束是(shi)去垢(gou)劑(ji)(ji)親水頭向(xiang)(xiang)外，疏(shu)水頭向(xiang)(xiang)內排列的(de)(de)聚集體形式(shi)。去垢(gou)劑(ji)(ji)溶(rong)解(jie)蛋白通(tong)過(guo)一(yi)端(duan)結(jie)(jie)合(he)蛋白的(de)(de)疏(shu)水部(bu)分(fen)，另一(yi)端(duan)結(jie)(jie)合(he)親水部(bu)分(fen)。去垢(gou)劑(ji)(ji)的(de)(de)選擇(ze)應該(gai)足夠溶(rong)解(jie)膜蛋白而不(bu)會(hui)造成不(bu)可(ke)逆的(de)(de)變性。常(chang)見的(de)(de)去垢(gou)劑(ji)(ji)見表二。

當(dang)篩選(xuan)去垢劑時，要注意每(mei)個去垢劑的(de)臨界膠(jiao)束濃度(du)（CMC）。CMC是(shi)指自由的(de)去垢劑分(fen)子形成膠(jiao)束結構(gou)需要的(de)濃度(du)。因為(wei)溶液相(xiang)當(dang)于膜蛋白從細胞(bao)膜上去除進入去垢劑膠(jiao)束，所以CMC是(shi)蛋白提取所需的(de)最低濃度(du)。CMC值(zhi)可參考表二。

四、去(qu)垢劑的篩選

為保證膜蛋白的溶解效率，需(xu)要對(dui)去(qu)垢(gou)劑類型及(ji)濃度進行篩選(xuan)：

去垢劑篩選條件建議

一(yi)般使用PBS或(huo)Tris buffer進行(xing)去垢劑篩選(xuan)

DDM常用作初(chu)始(shi)嘗(chang)試的去(qu)垢(gou)劑(ji)

CHAPS和digitonin被證明在(zai)畢(bi)赤酵母體系(xi)中的細(xi)胞膜(mo)溶解具有較好(hao)的效果

可以考慮多種去(qu)垢劑混(hun)合使用

一(yi)些脂(zhi)質(zhi)、小的(de)兩(liang)性物質(zhi)（如(ru)1,2,3-庚(geng)三醇）或(huo)目標蛋白的(de)一(yi)些已(yi)知配體可以(yi)提(ti)升膜的(de)溶解效率(lv)

五、去(qu)垢(gou)劑快速篩選

FSEC用于表(biao)(biao)達(da)條件和(he)去垢劑的(de)快(kuai)速(su)篩選。FSEC（Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography），又(you)叫熒(ying)光檢(jian)測尺寸排阻色譜法。具(ju)體方法是將目的(de)基(ji)因構(gou)建在帶(dai)有(you)GFP標簽的(de)融合表(biao)(biao)達(da)載體上，進行小量表(biao)(biao)達(da)。通過(guo)不(bu)同的(de)去垢劑溶解后，然后上樣微量色譜柱，使用AKTA系統的(de)紫(zi)外，熒(ying)光檢(jian)測器(qi)進行檢(jian)測（熒(ying)光檢(jian)測器(qi)需搭配）。由于目的(de)蛋白帶(dai)有(you)GFP標簽，使用熒(ying)光檢(jian)測會顯示(shi)出(chu)熒(ying)光信號。通過(guo)峰型和(he)峰面積(ji)我(wo)們可以檢(jian)測到蛋白表(biao)(biao)達(da)和(he)溶解情況。