二、方法

2.1. 中宇宙的實驗方法

海(hai)(hai)水(shui)是從墨西哥灣收集(ji)的(de)(de)(de)，用(yong)于(yu)填充 12 罐，每個(ge) 130 L，其中(zhong)(zhong) 4 個(ge)處理一式三份： 對(dui)照(zhao)（海(hai)(hai)水(shui)）、WAF（用(yong) Macondo 替代(dai)油(you)(you)，一種輕(qing)質低硫(liu)原(yuan)油(you)(you)，化學性質類似于(yu) 在(zai)(zai)(zai)深(shen)水(shui)期(qi)間從 Macondo 井(jing)中(zhong)(zhong)溢出(chu)的(de)(de)(de)石油(you)(you) Horizon 事件）、CEWAF（Corexit + oil 比例為(wei) 1:20）和 DCEWAF （CEWAF 稀釋十倍）。 仔細描(miao)述了(le)中(zhong)(zhong)間宇(yu)宙的(de)(de)(de)設置 在(zai)(zai)(zai)韋德等(deng)人。 (2017) 以(yi)及(ji)準(zhun)備 WAF 的(de)(de)(de)程序(xu)， CEWAF 和 DCEWAF。 簡(jian)而言(yan)之(zhi)，注入油(you)(you)或油(you)(you) + Corexit 進入帶擋板的(de)(de)(de)再(zai)循環罐并(bing)混(hun)合約(yue) 24 小時，然后(hou)將(jiang)下層 分數（即(ji)，避(bi)免表(biao)面(mian)光滑）被(bei)添(tian)加(jia)(jia)到(dao)各自(zi)的(de)(de)(de) 坦克(ke)。 有關中(zhong)(zhong)宇(yu)宙實(shi)驗的(de)(de)(de)信息在(zai)(zai)(zai)表(biao) 1 中(zhong)(zhong)給出(chu) 根(gen)據(ju)估計值添(tian)加(jia)(jia)初(chu)始(shi)和最終(zhong)(zhong)油(you)(you)濃度 根(gen)據(ju) Wade 等(deng)人確定(ding)的(de)(de)(de)油(you)(you)當量 (EOE)。 （2011 年，2017 年）。 實(shi)驗持續(xu) 3 到(dao) 5 天，運行 12:12 明暗(an)循環。 在(zai)(zai)(zai)表(biao) 1 中(zhong)(zhong)，對(dui)于(yu)使用(yong)沿(yan)海(hai)(hai) 用(yong)微生(sheng)物(wu)濃縮(suo)(suo)物(wu)修(xiu)(xiu)正(zheng)的(de)(de)(de)水(shui)域，浮游(you)生(sheng)物(wu)（≥63 μm）是 用(yong)網收集(ji)并(bing)轉移到(dao)聚碳酸酯瓶中(zhong)(zhong)。 這個(ge) 將(jiang)濃縮(suo)(suo)的(de)(de)(de)浮游(you)生(sheng)物(wu)塊引入罐中(zhong)(zhong)并(bing)攪拌（2 L 到(dao)每個(ge)）在(zai)(zai)(zai)開始(shi)實(shi)驗之(zhi)前。 對(dui)于(yu)公海(hai)(hai)水(shui)域和沿(yan)海(hai)(hai)水(shui)域的(de)(de)(de)中(zhong)(zhong)宇(yu)宙，營(ying)養(yang)物(wu)質進行了(le)修(xiu)(xiu)正(zheng)， 添(tian)加(jia)(jia)營(ying)養(yang)物(wu)（最終(zhong)(zhong)濃度 f/20）并(bing)攪拌罐。

表格(ge)1 中觀的實驗設計。

本研究(jiu)的(de)(de)樣品是從水(shui)柱(zhu)中提取(qu)的(de)(de) 24 小時，根(gen)據 Xu 等(deng)(deng)人詳細介紹的(de)(de)方法進行分(fen)析。 （2018a，2018b）。 簡(jian)而言(yan)之，對(dui)于(yu)本研究(jiu)，從水(shui)中提取(qu)的(de)(de)樣品等(deng)(deng)分(fen)試樣 通(tong)過(guo) 0.45 μm FlipMate 以(yi) < 100 mmHg 的(de)(de)壓(ya)力輕輕過(guo)濾(lv)色(se)譜柱(zhu) 去(qu)除顆粒的(de)(de)裝置 (Environmental Express SC0301C)。 這 然后(hou)在 3 kDa 超速(su)離(li)心(xin)膜(mo)（Amicon Ultra-15，EMD # UFC900396）中處(chu)(chu)理 0.45 μm 濾(lv)液(ye)以(yi)收集(ji)膠體（3 kDa 截留(liu)(liu)物(wu)）級分(fen)。 收集(ji) 3 kDa 截留(liu)(liu)物(wu)并(bing) 用(yong)(yong) 18 MΩ -cm 沖洗 3 次，直(zhi)到(dao)最終體積(ji)至少濃縮 25 倍(bei)。 這種 EPS 膠體部分(fen)來自(zi)(zi)水(shui)中 然后(hou)將 < 0.45 μm 和(he) > 3 kDa 的(de)(de)色(se)譜柱(zhu)用(yong)(yong)于(yu)本工作中提到(dao)的(de)(de)大(da)多(duo)數(shu)測(ce)量。 測(ce)量每個EPS膠體樣品 對(dui)于(yu)蛋白質和(he)多(duo)糖(tang)，如(ru)下(xia)所(suo)述，并(bing)用(yong)(yong) 3 kDa 超濾(lv)滲透液(ye)（真正溶解的(de)(de)部分(fen)；濾(lv)液(ye)） 3 kDa 超濾(lv)器）來自(zi)(zi)用(yong)(yong)于(yu)測(ce)量的(de)(de)對(dui)照處(chu)(chu)理 SFT 以(yi)保持原(yuan)始中宇宙樣本的(de)(de)離(li)子組成。

2.2. 化學品和實驗室器具準備

除(chu)非(fei)(fei)另有(you)說(shuo)明，所(suo)(suo)有(you)化學品(pin)均(jun)來自(zi) Sigma 并(bing)且是 97% 純 ACS 級或更高。 除(chu)非(fei)(fei)使(shi)用(yong)(yong)的水(shui)是天然海水(shui)，否則(ze)所(suo)(suo)有(you)使(shi)用(yong)(yong)的水(shui)都是 18 MΩ –cm Milli-Q I 型水(shui)。 除(chu)非(fei)(fei) 指定，ASW（Millero 1996，第 67 頁），單個(ge)組件 MgCl2、NaCl 和 Na2SO4 在 450°C 下燃燒 4 小(xiao)時。 所(suo)(suo)有(you)實驗(yan)室用(yong)(yong)品(pin) 用(yong)(yong)自(zi)來水(shui)沖(chong)洗(xi)三(san)(san)次(ci)，在 1% 的溶液中浸(jin)泡 12 小(xiao)時。 Micro-90® 肥皂溶液（VWR，目錄(lu)號(hao) 89210-140），用(yong)(yong) 18 MΩ –cm Milli-Q 水(shui)，在 3 M HCl 中浸(jin)泡 12 小(xiao)時，并(bing)沖(chong)洗(xi)三(san)(san)次(ci) 18 MΩ –cm Milli-Q 水(shui)。 如果使(shi)用(yong)(yong)玻璃器皿，則(ze)另外(wai) 在 450 °C 下燃燒 4 h。

2.3. 標準生物大分子實驗

為(wei)了(le)評估蛋(dan)白質(zhi)和多糖(tang)(tang)（單獨 或組合(he)）在 SFT 上，實驗是在人(ren)(ren)工 海(hai)水(shui)，ASW，使(shi)(shi)用牛(niu)血清白蛋(dan)白（BSA，來自 Pierce 蛋(dan)白 檢測試劑盒(he)，ThermoFisher），其等電點 pI 為(wei) 4.7–5.4 （視情況而定）。 此外(wai)，為(wei)了(le)代表多糖(tang)(tang)，我們(men) 使(shi)(shi)用過(guo)存在于(yu)(yu)水(shui)中的(de)葡萄(tao)糖(tang)(tang)醛(quan)酸（Sigma，CAS 6556-12-3） 墨西哥灣(wan)柱（Hung 等人(ren)(ren)，2003 年；Xu 等人(ren)(ren)，2011 年）。 它是一(yi)個 具(ju)有與 D-甘露(lu)糖(tang)(tang)醛(quan)酸相似(si)物(wu)理(li)化學性質(zhi)的(de)差向異(yi)構體(ti)和 L-古洛(luo)糖(tang)(tang)醛(quan)酸，海(hai)藻酸的(de)主要成分(fen)和豐富的(de) 細菌外(wai)聚(ju)合(he)物(wu)、生物(wu)膜和褐藻的(de)成分(fen)。 葡萄(tao)糖(tang)(tang)醛(quan)酸的(de) pKa 為(wei) 2.8-3.2（取決于(yu)(yu)分(fen)子構型(xing)）。 在 pH 值為(wei) ~8 的(de) ASW 中，這些部分(fen)將(jiang)被去質(zhi)子化，這將(jiang)增強它們(men)的(de)表面(mian)反應性。

2.4. 表面張力

SFT 使用(yong) Kibron EZ Pi-Plus 張(zhang)力計測(ce)(ce)量，該張(zhang)力計 采用(yong) Du Nouy-Paddy 技術結(jie)合(he) 0.5 mm 直徑探針（Padday 等人，1975 年）。 探針是金(jin)屬合(he)金(jin)的(de)(de) 一種親水(shui)性氧化物，與樣(yang)品的(de)(de)接(jie)觸可(ke)以忽略不計。 這 聚(ju)丙(bing)烯(xi)杯(bei)(bei)中的(de)(de) 1.5 mL 樣(yang)品使用(yong)循(xun)環水(shui)浴(yu)保持在 22.5 ± 0.3 °C 的(de)(de)恒溫。 探針是 通(tong)過用(yong)丁(ding)烷(wan)炬燃燒來清潔樣(yang)品之間。 每個 樣(yang)品至(zhi)少測(ce)(ce)量四(si)次，重復測(ce)(ce)量顯示 ≤ 5% 的(de)(de)相對(dui)標準(zhun)偏差 (RSD)。 這 儀器針對(dui) 18.2 MΩ –cm 電(dian)阻率(lv) I 型水(shui)進行校準(zhun)。 疏(shu)水(shui)部分(fen)的(de)(de)濃(nong)度(du)越高 EPS 膠體分(fen)數越低(di)，表面(mian)張(zhang)力越低(di)。 因(yin)此，由于(yu)聚(ju)丙(bing)烯(xi)杯(bei)(bei)可(ke)能(neng)會吸附樣(yang)品中分(fen)子的(de)(de)更多疏(shu)水(shui)成分(fen)，因(yin)此實(shi)際的(de)(de)表面(mian)張(zhang)力可(ke)能(neng) 低(di)于(yu)表觀測(ce)(ce)量值，因(yin)此我們的(de)(de)測(ce)(ce)量值是 保守的(de)(de)。

2.5. 蛋白質和多糖測定

EPS 中的蛋白質含(han)量(liang)是基于改良的二辛可寧酸方法（Smith 等人，1985 年）使(shi)用(yong) Pierce 蛋白質測定的 檢測試劑盒（ThermoFisher），以 BSA 為標(biao)準。

使(shi)用(yong)(yong)蒽(en)(en)酮(tong)方(fang)法（Morris 1948）測(ce)定(ding)中性糖(tang)濃(nong)度(du)(du)，以葡萄(tao)(tao)糖(tang)為(wei)標(biao)準(zhun)。 對(dui)于蒽(en)(en)酮(tong)試(shi)劑(ji)，0.05 g 蒽(en)(en)酮(tong)（CAS 90-44-8；終濃(nong)度(du)(du) 1 g/L 蒽(en)(en)酮(tong)）溶(rong)(rong)(rong)于 50 mL 濃(nong)硫酸(suan)中 玻(bo)(bo)璃(li)燒(shao)杯，然(ran)(ran)后(hou)(hou)攪(jiao)拌。 在(zai)(zai)每次應用(yong)(yong)此方(fang)法之前立即(ji)制備(bei)(bei)蒽(en)(en)酮(tong)試(shi)劑(ji)。 對(dui)于葡萄(tao)(tao)糖(tang) 標(biao)準(zhun)儲(chu)備(bei)(bei)液，將 50 mg 葡萄(tao)(tao)糖(tang)（CAS 50-99-7；終濃(nong)度(du)(du) 1 g/L 葡萄(tao)(tao)糖(tang)）溶(rong)(rong)(rong)解在(zai)(zai) 50 mL 離(li)心(xin)管中，然(ran)(ran)后(hou)(hou)填充(chong) 用(yong)(yong) Milli-Q 水(shui)定(ding)容至 50 mL。 標(biao)準(zhun)品(pin)(pin)的儲(chu)備(bei)(bei)溶(rong)(rong)(rong)液是 稀釋(shi)至最終體積 10 mL，例如(ru)，對(dui)于 5 mg/L 標(biao)準(zhun)品(pin)(pin) 溶(rong)(rong)(rong)液，0.05 mL 儲(chu)備(bei)(bei)溶(rong)(rong)(rong)液，用(yong)(yong) 9.95 mL Milli-Q 水(shui)稀釋(shi)。 然(ran)(ran)后(hou)(hou)抽取各(ge)標(biao)準(zhun)溶(rong)(rong)(rong)液 0.1 mL 和樣(yang)品(pin)(pin) 0.1 mL 放入單獨的 Pyrex 玻(bo)(bo)璃(li)管中。 我(wo)們向每個管中添加了 0.2 mL 蒽(en)(en)酮(tong)試(shi)劑(ji)溶(rong)(rong)(rong)液并在(zai)(zai) 100°C 下加熱(re) 10 分鐘。 之后(hou)(hou) 孵(fu)育，試(shi)管立即(ji)在(zai)(zai)冰浴(yu)中冷卻或 運(yun)行自來水(shui)，使(shi)它們迅速(su)達到室(shi)溫。 這(zhe) 在(zai)(zai)光(guang)電色度(du)(du)計中在(zai)(zai) 620 nm 處(chu)測(ce)量光(guang)密(mi)度(du)(du)。 該方(fang)法用(yong)(yong)于測(ce)定(ding)中性糖(tang)； 它不(bu)會(hui) 檢(jian)測(ce)帶電糖(tang)，如(ru)糖(tang)醛酸(suan)。

通過(guo)添加硼酸(suan)鈉 (75 mM) 來估計(ji)糖(tang)醛酸(suan) 濃硫(liu)酸(suan)和間羥(qian)基(ji)二苯，含葡萄糖(tang)醛酸(suan) 酸(suan)作為標準（Hung 和 Santschi 2001）。

蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)、中(zhong)(zhong)性(xing)糖(tang)(tang)(tang)和糖(tang)(tang)(tang)醛(quan)酸(suan)(suan)的(de)濃度， 以 BSA、葡萄糖(tang)(tang)(tang)和葡萄糖(tang)(tang)(tang)醛(quan)酸(suan)(suan)當(dang)量(liang)表示，相對于溶(rong)解的(de)有機(ji)碳(tan)（蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi) 53%，40% 中(zhong)(zhong)性(xing)糖(tang)(tang)(tang)，糖(tang)(tang)(tang)醛(quan)酸(suan)(suan) 37%）。 然后蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)與(yu)多(duo)糖(tang)(tang)(tang)的(de)比(bi)(bi)例(li)計(ji)算(suan)為蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)/TCHO，其中(zhong)(zhong)TCHO（總 碳(tan)水(shui)化合物=中(zhong)(zhong)性(xing)糖(tang)(tang)(tang)+糖(tang)(tang)(tang)醛(quan)酸(suan)(suan)）。 因此，蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)：多(duo)糖(tang)(tang)(tang)的(de)比(bi)(bi)例(li)是(shi)(shi)（蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi) * 0.53）/[（中(zhong)(zhong)性(xing)糖(tang)(tang)(tang) * 0.40）+（糖(tang)(tang)(tang)醛(quan)酸(suan)(suan) 酸(suan)(suan) * 0.37），其中(zhong)(zhong)所有濃度均以 mg-OC/L 為單位(wei)（OC 是(shi)(shi)有機(ji)的(de) 碳(tan)）。 EPS 組成和濃度計(ji)算(suan)公(gong)式為 從三個復制的(de)中(zhong)(zhong)胚層罐(guan)中(zhong)(zhong)收集的(de)樣(yang)品 每個處理（n = 3）。

2.6. 溶解有機碳測定

DOC 的(de)濃(nong)(nong)度(du)是在 Shimadzu TOC-L 分析儀上使用高溫燃燒法(fa)測(ce)(ce)(ce)量(liang)的(de)（Xu 等人，2011 年；Guo 等。 1994）。 來自 0.7 um 預(yu)燃 Whatman GFF 的(de)樣品濾液 用 2N HCl 溶(rong)液將膜酸化(hua)至 < pH 2，然(ran)后吹掃(sao) 用純空氣吹 10 分鐘以(yi)去除無機碳。 樣本是 然(ran)后在 680 °C 下燃燒并(bing)(bing)進行 CO2 測(ce)(ce)(ce)量(liang)以(yi)確(que)定碳量(liang)。 為了計算 DOC 濃(nong)(nong)度(du)， 減(jian)去系統空白并(bing)(bing)根據校準(zhun)計算 曲線使用羥基鄰苯二(er)甲酸鉀作為標準(zhun)。 樣品 波(bo)動(dong)系數(shu)超(chao)過 3% 測(ce)(ce)(ce)量(liang) 3 次(ci)， 給出(chu)最低波(bo)動(dong)因子的(de)兩個值的(de)平均(jun)值是 采納(na)。

2.7. 共聚焦激光掃描顯微鏡 (CLSM)

共聚焦激(ji)光掃描顯(xian)微鏡圖像是(shi)用 蔡司 LSM 880 共聚焦光譜顯(xian)微鏡成(cheng)像系統，使(shi)用 Zstack 軟件。 所有樣(yang)品均使(shi)用人工海(hai)(hai)水制(zhi)備(bei) (ASW) 購自 Sigma（S9883 海(hai)(hai)鹽）并以(yi)(yi) 40 g/L 配制(zhi)。 為了(le)制(zhi)備(bei) WAF，將(jiang) 200 μL Macondo 替代油緩慢(man)加(jia)入到 在(zai)(zai) 500 mL 硼(peng)硅玻(bo)璃制(zhi)成(cheng)的(de)(de)(de)瓶子(zi)中過濾 ASW 海(hai)(hai)水 帶有特氟龍襯里的(de)(de)(de)帽子(zi)。 攪拌混合物并使(shi)其平衡24小(xiao)(xiao)時以(yi)(yi)制(zhi)備(bei)WAF。 CEWAF 的(de)(de)(de)制(zhi)作方式(shi)相(xiang)同，除(chu)了(le) 在(zai)(zai)混合之前，Corexit 以(yi)(yi) 1:20 的(de)(de)(de) Corexit 與油的(de)(de)(de)比例添加(jia) 與 ASW（Chiu 等人，2017 年；Wade 等人，2017 年）。 Corexit 治療 除(chu)了(le)將(jiang) Corexit 添加(jia)到 ASW 組成(cheng) 0.1% 的(de)(de)(de)溶液(ye)(ye)。 溶液(ye)(ye)終(zhong)濃度 BSA 和海(hai)(hai)藻酸 (Sigma, CAS 9005-38-3) 的(de)(de)(de)濃度也為 0.1%。 這 將(jiang) 500 mL 處理(li)液(ye)(ye)倒置幾次，然后將(jiang) 20 μL 等分(fen)試樣(yang)移液(ye)(ye)到載(zai)玻(bo)片上，與 100 mM 金霉(mei)素孵育 (CTC, Sigma CAS 64-72-2) 染(ran)料溶液(ye)(ye)在(zai)(zai)每次處理(li)約(yue) 30分(fen)鐘。 如(ru)染(ran)料分(fen)布所示，分(fen)子(zi)擴散在(zai)(zai)小(xiao)(xiao)體(ti)積內快速。 圖像是(shi)在(zai)(zai)激(ji)發/發射(she) 495 nm/519 nm 在(zai)(zai) 1 毫(hao)秒的(de)(de)(de)時間內。

2.8. 掃描電子顯微鏡 (SEM)

SEM 樣(yang)品首先過(guo)(guo)濾到(dao) 0.03 um 聚(ju)碳(tan)酸酯上 跟蹤(zong)蝕(shi)刻膜過(guo)(guo)濾器（SPI Supplies, West Chester, PA, USA），然后(hou)(hou) 使(shi)(shi)用(yong)(yong) 4% 多聚(ju)甲(jia)醛固定，然后(hou)(hou)用(yong)(yong)磷酸鹽緩沖鹽水(shui) (PBS) 洗(xi)滌，然后(hou)(hou)用(yong)(yong)去(qu)離子水(shui)沖洗(xi)（Tsai 等(deng)人(ren)，2017 年(nian)）。 使(shi)(shi)用(yong)(yong) 30%、50%、75%、95% 和(he) 100% 的甲(jia)醇完成脫水(shui)（Tsai 等(deng)人(ren)，2017 年(nian)）。 使(shi)(shi)用(yong)(yong) CO2 臨(lin)界點干燥器去(qu)除(chu) 任何殘留溶劑(ji)。 最后(hou)(hou)，在上面濺(jian)射鍍(du)上一層(ceng)薄(bo)薄(bo)的金 這些基(ji)材。 然后(hou)(hou)使(shi)(shi)用(yong)(yong) FEI Quanta 200 獲取圖像(xiang) ESEM 系統（Tsai 等(deng)人(ren)，2017 年(nian)）。

蛋白質外聚物中多糖的比例——摘要、簡介

蛋白質外聚物中多糖的比例——方法

蛋白質外聚物中多糖的比例——結果與討論

蛋白質外聚物中多糖的比例——結論、致謝！