二、實驗

2.1 材料

二油酰(xian)磷(lin)脂(zhi)酰(xian)膽(dan)堿 (DOPC)、二棕(zong)櫚(lv)酰(xian)磷(lin)脂(zhi)酰(xian)絲氨酸 (DPPS)、膽(dan)固醇(chun) (Chol)、棕(zong)櫚(lv)酰(xian)鞘磷(lin)脂(zhi) (pSM) 和親脂(zhi)性熒光探針 La-磷(lin)脂(zhi)酰(xian)乙(yi)醇(chun)胺-N-（麗絲胺羅丹明 B 磺酰(xian)基）（銨 鹽）（雞(ji)蛋轉磷(lin)脂(zhi)酰(xian)化，雞(ji)肉）購自 Avanti 極(ji)性脂(zhi)質（阿拉巴(ba)斯特，阿拉巴(ba)馬(ma)州）。

在(zai) Cl3CH/CH3OH 2 : 1 v/v 中(zhong)制備(bei)脂質混合物 得(de)到 1 nmol mL 的(de)溶液？ 1 總濃度與所有 所使(shi)用(yong)(yong)的(de)溶劑和(he)(he)化學品具有最(zui)高(gao)的(de)商業價值 純(chun)度可用(yong)(yong)。 脂質單層(ceng)(ceng)和(he)(he)雙層(ceng)(ceng)的(de)制備(bei) 并在(zai) (22 ? 1) 1C 的(de) 0.145 M NaCl 亞相上表征 使(shi)用(yong)(yong)從 Milli-Q 系(xi)統 (Millipore) 獲得(de)的(de)水，18 MO cm。

透射(she)電(dian)子(zi)顯微鏡 (TEM) 網格用于 組裝(zhuang)獨立的平面(mian)雙層獲得 來自(zi) SPI Supplies（美國西切斯特）。

2.2 方法

2.2.1 脂膜觀察。

經(jing)典脂筏混合(he)(he)物(wu)(wu) 含有飽(bao)(bao)和(he)脂質、不飽(bao)(bao)和(he)脂質和(he)膽固(gu)醇 被用(yong)來進行實驗。 混合(he)(he)物(wu)(wu) DOPC : pSM (1 : 1) + 25% Chol 和(he) DOPC : DPPS (1:2) + 20% Chol 選(xuan)擇(ze)用(yong)于中性和(he)帶電域的(de)實驗， 分別(bie)。 呈現相(xiang)分離(li)的(de)組合(he)(he)物(wu)(wu)是(shi) 選(xuan)擇(ze)的(de)目的(de)是(shi)觀(guan)察和(he)跟(gen)蹤領域 單層(ceng)和(he)雙層(ceng)的(de)微米尺寸。 為(wei)了那個原因 目的(de)是(shi)將 1 mol% 的(de)熒光探(tan)針加(jia)入到 混合(he)(he)物(wu)(wu)。 由于熒光探(tan)針濃(nong)度較(jiao)密 相(xiang)較(jiao)低，液相(xiang)有序相(xiang)中的(de)域 (Lo) 在顯(xian)微照片(pian)中顯(xian)得(de)更暗。 富集(ji)Lo相(xiang) 每種混合(he)(he)物(wu)(wu)中的(de) pSM 和(he) Chol 或 DPPS 和(he) Chol。40-44

脂質單層的(de)制備和表征使用(yong)(yong) Langmuir 薄膜天平（微孔、Kibron、赫爾辛基、 芬蘭）置于(yu)倒置熒光的(de)舞(wu)臺上(shang) 顯微鏡（Axiovert 200，Carl Zeiss，Oberkochen，德國），物鏡為 20、40 或 100。 圖像已(yi)注冊(ce) 使用(yong)(yong) CCD 攝像機（IxonEM+ 型號 DU-897，Andor 技(ji)術(shu)）。

獨(du)立的(de)(de)(de)(de)(de)(de)平(ping)面(mian)(mian)脂質雙層是通過形(xing)成的(de)(de)(de)(de)(de)(de) 使用(yong)鍍金(jin) TEM 網格(ge)(ge)的(de)(de)(de)(de)(de)(de) Langmuir-Blodgett 轉移 3 毫米直(zhi)徑，帶有 200 個(ge)(ge)六邊形(xing)穿孔(kong)，每個(ge)(ge)穿孔(kong) 100 毫米。 金(jin)表(biao)(biao)面(mian)(mian)用(yong)十八烷(wan)(wan)(wan)(wan)基硫(liu)醇修飾 產生(sheng)疏水性底(di)物(wu)，如前所述。 39,45 在(zai)進行(xing)沉積之(zhi)前，對網格(ge)(ge)進行(xing)了預處(chu)理 1 mL 4% v/v 十六烷(wan)(wan)(wan)(wan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)己烷(wan)(wan)(wan)(wan)溶(rong)液(ye)。 一次己烷(wan)(wan)(wan)(wan) 蒸發，剩(sheng)余的(de)(de)(de)(de)(de)(de)十六烷(wan)(wan)(wan)(wan)提供適當的(de)(de)(de)(de)(de)(de) 雙層形(xing)成的(de)(de)(de)(de)(de)(de)高原-吉布(bu)斯邊界（圓(yuan)環）。40,46,47 In 這(zhe)樣，含有所需混合物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)單(dan)層被 壓(ya)縮到(dao) 28 mN m? 1 ，然后表(biao)(biao)面(mian)(mian)壓(ya)力為 在(zai)薄膜(mo)轉移過程中保持恒定。 這(zhe)個(ge)(ge)表(biao)(biao)面(mian)(mian)壓(ya)力是 足夠高以(yi)實現有效的(de)(de)(de)(de)(de)(de)薄膜(mo)轉移，以(yi)及 低(di)到(dao)仍然存在(zai)相(xiang)分離，因為臨界 這(zhe)些混合物(wu)在(zai) 22 1C 的(de)(de)(de)(de)(de)(de)點接近 33 mN m? 1 . 這(zhe) 底(di)物(wu)通過脂質界面(mian)(mian)垂直(zhi)下(xia)降，并平(ping)行(xing)于玻璃底(di)部放置 槽，以(yi)便(bian)使用(yong)倒置的(de)(de)(de)(de)(de)(de)觀察雙層 顯微鏡。 雙層保持在(zai)亞(ya)相(xiang)下(xia)， 穩定了幾(ji)個(ge)(ge)小時。

實驗裝置允許原位可視化 沉積(ji)后的(de)單層(ceng)和雙層(ceng)如(ru)圖(tu)所(suo)示(shi) 圖(tu) 1A。 單層(ceng)的(de)代表性圖(tu)像和 還顯(xian)示(shi)了雙層(ceng)。 中(zhong)性單層(ceng)的(de)顯(xian)微照片 圖(tu) 1B 顯(xian)示(shi)了在薄(bo)膜(mo)轉移(yi)之(zhi)前(qian)。 之(zhi)后立馬 其轉移(yi)，雙層(ceng)熒光出現均(jun)勻 （見圖(tu) 1C），但(dan)在 10-15 分鐘(zhong)后，相分離 觀察到（圖(tu) 1D 和 E）。 這個滯(zhi)后時(shi)(shi)間是一(yi)(yi)致的(de) 自(zi)發變薄(bo)過程所(suo)需(xu)的(de)時(shi)(shi)間 由于溶劑從雙層(ceng)中(zhong)間遷移(yi)到 支持邊界(jie)。47,48 一(yi)(yi)些雙層(ceng)在 當電(dian)網容納時(shi)(shi)轉移(yi)或通(tong)過水通(tong)量 觀察，可以在圖(tu) 1C 的(de)右下(xia)角觀察到。 此外，中(zhong)性和帶(dai)電(dian)雙層(ceng)顯(xian)示(shi)在 圖(tu)1D和E分別。 分析的(de)區域(yu)對應 總是在雙層(ceng)的(de)中(zhong)心以避(bi)免影響 由于靠近高原-吉布(bu)斯邊界(jie)（方形 在圖(tu)1E）。

圖(tu) 1 用(yong)于生成和觀察(cha)朗繆(mou)爾(er)單層和平(ping)面獨立雙(shuang)(shuang)層的(de)(de)實驗裝(zhuang)置 (A)。 代表性(xing)圖(tu)像顯示(shi) 表面壓力為 28 mN m 的(de)(de)中(zhong)性(xing)朗繆(mou)爾(er)單層膜？ 1 (B), 轉(zhuan)移后立即包含多個同質雙(shuang)(shuang)層 (C) 的(de)(de)網(wang)格, 和 突出顯示(shi)的(de)(de)孔（C 中(zhong)的(de)(de)插(cha)圖(tu)）的(de)(de)放大圖(tu)，以及顯示(shi)相共存的(de)(de)中(zhong)性(xing) (D) 和帶(dai)電(dian)雙(shuang)(shuang)層 (E)。 橙色虛(xu)線(xian)方塊 (E) 中(zhong)顯示(shi)的(de)(de)是用(yong)于分析的(de)(de)區域的(de)(de)示(shi)例。

應該注意的(de)(de)(de)是(shi)，用于(yu)此的(de)(de)(de)雙層域 研究(jiu)總是(shi)通(tong)過兩個半層耦(ou)合，并且僅(jin)在(zai) 孤立的(de)(de)(de)案(an)例域出現(xian)解耦(ou)，如提議(yi)的(de)(de)(de)那樣 此域大小(xiao)范(fan)圍（參見 ESI，? S1）。49 域間斥力(li)隨(sui)著距離(li)的(de)(de)(de)減小(xiao)而(er)變化 在(zai)相(xiang)似區域的(de)(de)(de)域之(zhi)間，這(zhe)是(shi)通(tong)過 增(zeng)加(jia)液(ye)體占據(ju)的(de)(de)(de)總面積 ESI? (S2) 中詳述的(de)(de)(de)有(you)序(xu)相(xiang) (%Lo)。

據(ju)我們所知(zhi)，這是第(di)一次，這種雙(shuang)(shuang)層(ceng) 在 TEM 網格(ge)(ge)上形(xing)成的(de)系統(tong)用(yong)于查看和研究系統(tong) 呈現相分離。 注意(yi)優(you)點之(zhi)一 這個(ge)(ge)實驗(yan)設置的(de)一個(ge)(ge)特點是轉移后(hou)，雙(shuang)(shuang)層(ceng)是 形(xing)成在網格(ge)(ge)的(de)幾乎所有(you)孔中(zhong)，允(yun)許分析(xi) 從(cong)單個(ge)(ge)實驗(yan)中(zhong)獲得的(de)多(duo)個(ge)(ge)雙(shuang)(shuang)層(ceng)，以(yi)及(ji) 改進(jin)數據(ju)采集和統(tong)計。

2.2.2 域跟蹤和擴散測量。

在(zai) 為了(le)獲(huo)得域(yu)的擴散(san)系數（D），對 小(xiao)域(yu)（1-3 毫(hao)米半徑）在(zai)視頻中被跟蹤 15–20 秒（150–200 幀(zhen)，每幀(zhen) 0.1 秒）如所述(shu) 50 軟件程序 Image-J 用于(yu)執行 允許圖像分割(ge)和插件"Mosaic Suite" 通過圖像跟蹤粒子。 51 有(you)關(guan)更多詳細信息(xi) 以及獲(huo)得的圖像分割(ge)和軌(gui)跡的示例 在(zai)對流阻力下，參(can)見 ESI?（S3 和 S4）。

2.2.3 域和均值的徑向分布函數 力相互作用勢。

徑(jing)向分布(bu)函(han)數(shu) g(r) 是為(wei)膜平面(mian)上的(de)域(yu)(yu)計算的(de) 雙層和單(dan)層作為(wei)數(shu)量的(de)函(han)數(shu) 域(yu)(yu)，由有序(xu)液體的(de)面(mian)積百(bai)分比量化 相(xiang)狀態，%Lo。 150幀的(de)視頻分為(wei)三個 部分，以及域(yu)(yu)中心(xin)之間距離(li)的(de)直方(fang)圖 (r) 使用(yong)來自 50 個連續幀的(de)數(shu)據構建，并(bing)且 報告的(de) g(r) 值是平均(jun)這些直方(fang)圖的(de)結果。

根據上述測定，平(ping)均(jun)力勢為 計算依據：

其中 b 是 (kT)？ 1 和 w(r) 表(biao)示平(ping)均力勢(shi) 域之間。 52 w(r) 曲線的(de)(de)(de)第(di)一(yi)個(ge)(ge)谷(gu)（其中 對(dui)應于(yu) g(r) 曲線的(de)(de)(de)第(di)一(yi)個(ge)(ge)峰）被(bei)擬合為 二次函數和從它(ta)的(de)(de)(de)曲率(lv)一(yi)個(ge)(ge)有效的(de)(de)(de)彈簧 計算常數，用于(yu)量化 域間交互(hu)。

2.2.4 域合并。

以量化比率為目的(de) 域的(de)融合，雙層(ceng)和單(dan)(dan)層(ceng)的(de)視頻(pin)是 拍攝(she) 15-30 分鐘，中(zhong)間間隔 5 秒 幀。 相對于第一張顯(xian)微照(zhao)片計算了(le)一段時間內(nei)的(de)域數量，每(mei)個照(zhao)片平均 12 張 分鐘。 這些視頻(pin)是針對 40%Lo 的(de)膜拍攝(she)的(de) 所有系統，并(bing)在(zai) 28 mN m 的(de)固定表面壓力下？ 1 在(zai) 朗繆(mou)爾(er)單(dan)(dan)層(ceng)的(de)情況。 時間零是在(zai)此刻設置的(de) 在(zai)雙層(ceng)情況下的(de)域外觀，以及(ji)在(zai)點(dian) 達到了(le)單(dan)(dan)層(ceng)所需的(de)表面壓力。

微尺度區域內靜電相互作用力動態調節和脂質雙分子層的分布——摘要、簡介

微尺度區域內靜電相互作用力動態調節和脂質雙分子層的分布——實驗材料和方法

微尺度區域內靜電相互作用力動態調節和脂質雙分子層的分布——結果和討論

微尺度區域內靜電相互作用力動態調節和脂質雙分子層的分布——結論、致謝！