2、材料和方法

2.1. 材料

人血(xue)紅蛋白 (Hb) 購自 Sigma-Aldrich 并(bing)按(an)原樣(yang)使(shi)用(yong)。 雙子表面(mian)活性劑 乙烷-1, 2-diyl bis (N, N-二甲基-N-十(shi)六烷基乙酰氧基)二氯化物(wu)[16- E2-16]如[40]中(zhong)所述(shu)合成(cheng)，其結構(gou)為 如方案 1 所示(shi)。整(zheng)個(ge)過程中(zhong)都使(shi)用(yong)了 Millipore 水 實驗。 Hb (5 μM) 的儲備溶液在 100 mL 10 mM 磷酸鈉緩沖液 (pH 7.4) 而(er) 16-E2-16 的儲備溶液在水中(zhong)制備。 使(shi)用(yong)分光光度(du)法測定 Hb 的濃度(du) 280 nm 處的消光系數 118872 M-1 cm-1。

2.2. 方法

2.2.1. 表面張力分析

表(biao)面張力由 Delta-Pi Langmuir 測量 微張力計(ji)（Kibron，赫(he)爾辛基，芬蘭）基于桿上的最大拉(la)力（Du Nouy-Padday）并利(li)用小直徑 (0.51 mm) 特殊合金線。 通過滴定法將16-E2-16加入到Hb溶液中。 樣(yang)品的值(zhi)是在 298.15 K、308.15K 和 318.15K。

測(ce)(ce)量池(chi)的溫(wen)度(du)由以下(xia)控(kong)制： Grant GD120 水溫(wen)控(kong)器。 每次溫(wen)度(du)測(ce)(ce)量后，將合金線清洗并在酒精中干燥 火焰。

2.2.2. 吸光度測量

吸收(shou)光(guang)(guang)譜(pu)(pu)在(zai)配備(bei)(bei)珀耳帖型溫度控(kong)制器的 Jasco-660 分(fen)光(guang)(guang)光(guang)(guang)度計中測量 (ETCS761)。 使用的蛋(dan)白(bai)(bai)質(zhi)濃(nong)度為 5 μM，用于光(guang)(guang)譜(pu)(pu) 700–300 cm?1 范圍(wei)內的測量值(zhi)。 使用光(guang)(guang)程長度為 1.0 cm 的池。 將 2000 μL 的 5 μM 蛋(dan)白(bai)(bai)溶液放(fang)入 放(fang)入 1.0 cm 比色皿中，并用 20 μM 儲備(bei)(bei)溶液滴定 16-E2-16。 每次滴定加入 40 μL，譜(pu)(pu)圖為 記錄。基線校正總是針對(dui)空(kong)白(bai)(bai)進行。

2.2.3. 熒光光譜測量

Trp熒光(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)和同(tong)步熒光(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu) 在(zai) Jasco 熒光(guang)(guang)(guang)分光(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)度(du)計（FP-6200 型(xing)）中使(shi)用 3 mm 石英池在(zai) 25 ± 0.1 °C 下測量(liang)天然(ran)條件下的(de) Hb。 這 電池的(de)溫度(du)通(tong)過來自(zi)外部恒溫水浴的(de)循環水來維持。 使(shi)用的(de)蛋白質濃度(du) 為 5 μM。 激發(fa)波(bo)長(chang)為 280 nm，發(fa)射光(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)記(ji)錄在(zai) 300-400 nm 波(bo)長(chang)范圍內。 由緩沖液(ye)和表面(mian)活(huo)性劑(ji)組(zu)成(cheng)的(de)參考樣品 檢查熒光(guang)(guang)(guang)信號。 2000 μL 操作溶液(ye) 通(tong)過連續添加(jia) 40 μL 16-E2-16 (20 μM) 儲備溶液(ye)來滴定 5 μM Hb。 滴定是通(tong)過使(shi)用手動完成(cheng)的(de) 一個微量(liang)移液(ye)器。 同(tong)步熒光(guang)(guang)(guang)光(guang)(guang)(guang)譜(pu)(pu)的(de)波(bo)長(chang)間隔 (αl) 為酪(lao)氨酸(suan)殘(can)基 (Tyr) 為 20 nm 和 80 nm 分別為色(se)氨酸(suan)殘(can)基 (Trp)。

2.2.4. 圓二色性測量

CD 光譜記錄(lu)在 Jasco-715 分光偏振計(ji)上， 配(pei)備(bei)微型計(ji)算機(ji)。 儀器已校準(zhun) (+)-10-樟(zhang)腦(nao)磺(huang)酸。 所有 CD 測量值均(jun)為(wei) 使(shi)(shi)用(yong)恒(heng)溫控(kong)制的細(xi)胞架(jia)在 298K 下(xia)進(jin)行 連(lian)接到(dao) Neslab RTE-110 水浴，精(jing)度(du)為(wei) ±0.1K。 蛋白質二級結構(gou)的變化(hua)是 使(shi)(shi)用(yong) 1 mm 路徑在遠(yuan)紫外區域 (200–250 nm) 進(jin)行監測 長單(dan)元格。 來(lai)自(zi)含有緩沖液的參考樣品的信(xin)(xin)號 并(bing)且從所有的 CD 信(xin)(xin)號中減(jian)去(qu)去(qu)污劑 測量。 CD 儀器定期用(yong) D- 10-樟(zhang)腦(nao)磺(huang)酸。 為(wei)了(le)提高信(xin)(xin)噪比，在 每次掃(sao)描至少進(jin)行六次累積。 CD 數據被轉換為(wei)濃度(du)無關(guan)參數，平均(jun)殘留量 橢圓度(du) [β] (deg cm2 dmol?1)，使(shi)(shi)用(yong)關(guan)系式 [43]

其中 θλ 是在波長(chang)處(chu)觀察到的(de)橢圓度(du)（以(yi)毫度(du)為(wei)單位） λ，M0 是蛋白質的(de)平均殘基重量，c 是蛋白質 以(yi)克/立方厘(li)(li)米為(wei)單位的(de)濃度(du)，l 是細胞的(de)光(guang)程長(chang)度(du)，以(yi)厘(li)(li)米為(wei)單位。 222 nm 處(chu)的(de)橢圓度(du)值 (θ222nm/mdeg)用于計算BSA的(de)α-螺旋含量 使用 Morrisett 等人給出的(de)以(yi)下等式(shi)。 [44]

2.2.5. 分子對接

進(jin)行(xing)(xing)分(fen)子(zi)對(dui)接(jie)(jie)以確定蛋(dan)白(bai)質 Gemini 表面(mian)活性(xing)劑結(jie)(jie)(jie)合親(qin)和(he)力、結(jie)(jie)(jie)合常(chang)數以及 識別潛在(zai)的(de)結(jie)(jie)(jie)合位點和(he)相鄰的(de)相互作用(yong) Hb 和(he) 16-E2-16 之間(jian)。 血(xue)紅蛋(dan)白(bai)的(de)晶體結(jie)(jie)(jie)構 (PDB ID: 2D60) 來自蛋(dan)白(bai)質數據庫。 16-E2-16的(de)結(jie)(jie)(jie)構由ChemDraw Ultra 8.0構建。 這 使用(yong)分(fen)子(zi)對(dui)接(jie)(jie)軟件 AutoDock Vina [45] 進(jin)行(xing)(xing)對(dui)接(jie)(jie)實驗。 盲對(dui)接(jie)(jie)是由 沿 x、y、z 軸將網(wang)格大小(xiao)設置(zhi)為 58、50、54，網(wang)格間(jian)距(ju)為 1000?。 網(wang)格中(zhong)心設置(zhi)為 15.499?、3.439?、14.787?。 如 AutoDock Vina 中(zhong)所述使用(yong)默(mo)認參數 手(shou)動(dong)的(de)。 總(zong)共進(jin)行(xing)(xing)了 10 次運行(xing)(xing)，然(ran)后 根據排名選擇最(zui)低能量構象異構體 得分(fen)。 分(fen)子(zi)對(dui)接(jie)(jie)結(jie)(jie)(jie)果由 PyMOL [46] 呈現。

2.2.6. 分子動力學模擬

GROMACS 5.0 軟件(jian) [47,48] 用(yong)于進行 MD 對未結(jie)合和(he)(he) 16-E2-16 有(you)界 Hb 的(de)(de)(de)模擬。 建立(li) Hb 分子的(de)(de)(de)電(dian)位，GROMOS96 43a1 力場 [49,50] 被應用(yong)。 16-E2-16的(de)(de)(de)最低(di)能(neng)(neng)量對接(jie)構象 用(yong)于MD模擬，內置拓撲(pu)參數 ProGrg 服務器 [51]。 未結(jie)合和(he)(he) C16 結(jie)合的(de)(de)(de) Hb 被溶劑化(hua) SPC 水(shui)模型(xing) [52] 在(zai)十二(er)面體盒(he)中(zhong)(zhong)，包(bao)含 7174 和(he)(he) 6587 個(ge)(ge)(ge)(ge)分子。 添加(jia)單(dan)個(ge)(ge)(ge)(ge)鈉離子 在(zai)兩個(ge)(ge)(ge)(ge)系(xi)統(tong)中(zhong)(zhong)以中(zhong)(zhong)和(he)(he)整個(ge)(ge)(ge)(ge)系(xi)統(tong)。 那么能(neng)(neng)量為 兩個(ge)(ge)(ge)(ge)系(xi)統(tong)都使(shi)用(yong) 800 步最速下降進行了(le)最小化(hua) 算法后跟水(shui)箱中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)共軛梯度法，用(yong)于釋(shi)放沖突(tu)接(jie)觸。 應用(yong)了(le)兩個(ge)(ge)(ge)(ge)最小化(hua)系(xi)統(tong) 在(zai) 300K 時達到 100 ps 的(de)(de)(de)位置限制(zhi)動態，其中(zhong)(zhong) Hb 和(he)(he) Hb-(16-E2-16)復(fu)合物通過添加(jia)抑(yi)制(zhi)保持固定(ding) 然而，水(shui)分子被允許(xu)運動。 最后一步，兩個(ge)(ge)(ge)(ge)系(xi)統(tong)的(de)(de)(de) MD 模擬在(zai) 300K、1 bar 和(he)(he) 0.1 ps 下的(de)(de)(de)等溫-等壓合奏使(shi)用(yong) 貝倫(lun)森方法。 LINCS [53] 算法用(yong)于約束(shu)鍵(jian)長，允許(xu)使(shi)用(yong) 2 fs 時間步長。 范德 瓦爾(er)斯和(he)(he)庫侖相互作用(yong)在(zai) 1.2 nm 處被截斷。 MD模擬的(de)(de)(de)所有(you)分析都是(shi)使(shi)用(yong)軌(gui)跡分析工具(ju)進行的(de)(de)(de) GROMACS 軟件(jian)包(bao)。

酯功能化的雙子表面活性劑與血紅蛋白的結合——摘要、簡介

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