小腸(chang)(chang)(chang)(chang)（hSI）是(shi)人類重(zhong)要的(de)(de)(de)(de)器(qi)官(guan)(guan)，執(zhi)行著(zhu)包括(kuo)消(xiao)化(hua)在內(nei)的(de)(de)(de)(de)眾多功能，包括(kuo)但不(bu)限于初始(shi)(shi)和(he)(he)選擇性屏(ping)障活(huo)動、營(ying)養吸(xi)收(shou)、宿(su)主-微生(sheng)物(wu)相(xiang)互作(zuo)用，以及(ji)宿(su)主防御和(he)(he)免疫反應的(de)(de)(de)(de)調節。口(kou)服給藥(yao)(yao)是(shi)最常見的(de)(de)(de)(de)給藥(yao)(yao)方式(shi)，許多藥(yao)(yao)物(wu)在小腸(chang)(chang)(chang)(chang)中被吸(xi)收(shou)并開始(shi)(shi)代謝(xie)。過去十年(nian)，研(yan)究者嘗試(shi)總結體內(nei)腸(chang)(chang)(chang)(chang)道(dao)復(fu)雜生(sheng)理功能的(de)(de)(de)(de)各(ge)個方面(mian)，并利用人類結腸(chang)(chang)(chang)(chang)腺癌細(xi)胞(bao)系（Caco-2）以及(ji)人工膜(mo)系統，來建立評估藥(yao)(yao)物(wu)在小腸(chang)(chang)(chang)(chang)中的(de)(de)(de)(de)吸(xi)收(shou)和(he)(he)代謝(xie)的(de)(de)(de)(de)實驗模(mo)(mo)(mo)型(xing)。然而，現有的(de)(de)(de)(de)模(mo)(mo)(mo)型(xing)無法(fa)充分模(mo)(mo)(mo)擬hSI的(de)(de)(de)(de)功能，也無法(fa)反映藥(yao)(yao)物(wu)轉(zhuan)運體、藥(yao)(yao)物(wu)代謝(xie)酶和(he)(he)緊密連接的(de)(de)(de)(de)表達模(mo)(mo)(mo)式(shi)所扮演的(de)(de)(de)(de)重(zhong)要作(zuo)用。此外，這些模(mo)(mo)(mo)型(xing)中缺乏(fa)細(xi)胞(bao)色素P450酶(CYP3A4)，而hSI中最豐富(fu)的(de)(de)(de)(de)藥(yao)(yao)物(wu)代謝(xie)酶正是(shi)P450，這導致了Caco-2模(mo)(mo)(mo)型(xing)不(bu)適合研(yan)究腸(chang)(chang)(chang)(chang)道(dao)首過效應和(he)(he)生(sheng)物(wu)利用度。近年(nian)來，原代人腸(chang)(chang)(chang)(chang)上皮(pi)細(xi)胞(bao)（hIEC）模(mo)(mo)(mo)型(xing)的(de)(de)(de)(de)發(fa)展取得了顯(xian)著(zhu)進展，例如3D人體腸(chang)(chang)(chang)(chang)道(dao)類器(qi)官(guan)(guan)（hIOs）。但由于人體腸(chang)(chang)(chang)(chang)道(dao)類器(qi)官(guan)(guan)內(nei)缺乏(fa)增殖(zhi)細(xi)胞(bao)群，難以將腸(chang)(chang)(chang)(chang)上皮(pi)細(xi)胞(bao)培(pei)養成融合的(de)(de)(de)(de)單(dan)分子層，因此從(cong)人體腸(chang)(chang)(chang)(chang)道(dao)類器(qi)官(guan)(guan)生(sheng)成單(dan)層hSI模(mo)(mo)(mo)型(xing)十分困難。

鑒于此，韓國生命工學研究院的(de)一項研究開發了(le)一種(zhong)重(zhong)復性良好的(de)兩步方法來(lai)誘導人多能干細(xi)胞(bao)分化為可擴大(da)的(de)hIEC祖細(xi)胞(bao)和具有功能性的(de)hIEC單層細(xi)胞(bao)。

為了(le)從人多功(gong)能(neng)干(gan)細胞(bao)（hPSCs）中獲得(de)單層hSI模型，研究者建立了(le)一種新的(de)定向(xiang)分化方案，來模擬體(ti)內腸(chang)道(dao)發育(yu)過(guo)程。該方案采用激(ji)活素A（Activin A）、表皮(pi)生(sheng)長因子（EGF）、Wnt信號通(tong)路激(ji)動劑R-spondin 1和(he)胰島素等來誘(you)導hPSCs向(xiang)hIEC祖細胞(bao)分化，并(bing)進一步分化為有功(gong)能(neng)性的(de)hIEC。經過(guo)長時(shi)間(jian)傳代后（大于(yu)10代，培(pei)養大于(yu)5個(ge)月(yue)），腸(chang)細胞(bao)標記物和(he)緊(jin)密連接分子的(de)表達沒有明(ming)顯變化，腸(chang)上皮(pi)功(gong)能(neng)相關實驗同樣使用Transwell系統(tong)。

圖1｜由(you)hPSCs分化hIECs的(de)過程與相關表征

由于(yu)在hSI中(zhong)，Wnt的(de)抑(yi)制和Notch的(de)激(ji)活有助于(yu)祖細胞分(fen)(fen)化(hua)(hua)為(wei)吸收前(qian)上(shang)皮細胞，研究(jiu)者(zhe)使用了Wnt信號(hao)抑(yi)制劑Wnt-c59和Notch信號(hao)激(ji)動劑丙戊酸(VPA)，來進(jin)一(yi)步將hIEC祖細胞分(fen)(fen)化(hua)(hua)為(wei)與(yu)體內類(lei)似(si)的(de)成(cheng)熟且有功(gong)能的(de)hIEC。與(yu)其(qi)他僅由吸收性(xing)腸(chang)(chang)細胞組成(cheng)的(de)小腸(chang)(chang)上(shang)皮模(mo)型相比，該系(xi)統(tong)可(ke)以(yi)模(mo)擬體內樣腸(chang)(chang)組織(zhi)進(jin)行研究(jiu)。與(yu)未成(cheng)熟的(de)hIECs相比，功(gong)能性(xing)hIECs形成(cheng)了一(yi)個結構極化(hua)(hua)的(de)單層(ceng)，并(bing)觀察到(dao)了類(lei)似(si)杯狀細胞分(fen)(fen)泌出的(de)粘液(ye)。此外，功(gong)能性(xing)單分(fen)(fen)子(zi)層(ceng)hIEC的(de)頂表面接(jie)觸的(de)細菌數量明顯更(geng)高(gao)，并(bing)且黏液(ye)蛋(dan)白和黏液(ye)蛋(dan)白相關基因的(de)表達在功(gong)能性(xing)hIEC中(zhong)顯著(zhu)增加能夠允(yun)許腸(chang)(chang)道微(wei)生(sheng)物(wu)群的(de)持續定植。

圖2｜功能性hIECs單層模型(xing)的結構與功能表征(zheng)

隨(sui)后(hou)，研(yan)究(jiu)分析了(le)各種腸(chang)道(dao)轉(zhuan)運體和(he)(he)代(dai)謝酶(mei)的(de)表(biao)達(da)(da)水平，通過(guo)RNA測序與(yu)(yu)酶(mei)活(huo)性(xing)(xing)檢測，發現腸(chang)道(dao)堿性(xing)(xing)磷(lin)酸酶(mei)（IAP）和(he)(he)CYP3A4在(zai)功能性(xing)(xing)hIEC中表(biao)達(da)(da)量相(xiang)(xiang)當高，這些結果表(biao)明功能性(xing)(xing)hIEC具(ju)有藥(yao)物(wu)(wu)轉(zhuan)運體和(he)(he)藥(yao)物(wu)(wu)代(dai)謝酶(mei)活(huo)性(xing)(xing)，是評價藥(yao)物(wu)(wu)體外(wai)生(sheng)物(wu)(wu)利(li)用度(du)所必需的(de)。本研(yan)究(jiu)使用了(le)6種臨床藥(yao)物(wu)(wu)：美(mei)托洛(luo)爾(er)、普(pu)萘洛(luo)爾(er)、雙氯芬酸、雷尼替丁(ding)、呋(fu)塞米和(he)(he)紅霉素，進行體外(wai)藥(yao)物(wu)(wu)吸收(shou)試驗，發現與(yu)(yu)Caco-2模型不理想的(de)體內外(wai)相(xiang)(xiang)關性(xing)(xing)相(xiang)(xiang)比(bi)，功能性(xing)(xing)hIEC與(yu)(yu)已公(gong)布的(de)人(ren)體內腸(chang)道(dao)吸收(shou)數據擬合的(de)相(xiang)(xiang)關性(xing)(xing)良好，說明功能性(xing)(xing)hIEC可(ke)以更好地預測人(ren)的(de)口服生(sheng)物(wu)(wu)利(li)用度(du)和(he)(he)吸收(shou)程度(du)。

圖3｜6種臨床(chuang)模型藥物在功能性hIECs與Caco-2模型上吸收的(de)擬(ni)合結果

總而言之(zhi)，此(ci)研究發明(ming)了一套可(ke)靠(kao)且完善的hIECs培養系(xi)統(tong)，可(ke)以用來產生具有接近體(ti)內功能的小腸上皮單層，以取(qu)代(dai)目(mu)前(qian)的體(ti)外模(mo)型(xing)，提供一個新的通用的藥(yao)物體(ti)外腸吸收的檢測(ce)平臺。