摘要

本(ben)文(wen)首次描(miao)述(shu)了(le)一種(zhong)與磷脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)相(xiang)(xiang)關(guan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)高(gao)通量熒光。陰離子兩親磷脂(zhi)(zhi)可(ke)以在水溶(rong)液中形成復(fu)合物(wu)(wu)(wu)，其臨界膠束(shu)濃(nong)度(CMC)可(ke)以使(shi)用熒光探(tan)針N,N-二甲基(ji)-6-丙(bing)酰-2-萘胺(Prodan)測(ce)(ce)(ce)定(ding)。在與候選藥(yao)物(wu)(wu)(wu)相(xiang)(xiang)互作(zuo)用時，由于脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)和候選藥(yao)物(wu)(wu)(wu)之間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)關(guan)聯，該CMC可(ke)能會(hui)轉變為較低的(de)(de)(de)(de)(de)(de)值，相(xiang)(xiang)互作(zuo)用越強，轉變越大。藥(yao)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)代謝可(ke)以根據代謝速(su)率和代謝物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)性(xing)質(zhi)(zhi)(zhi)改變磷脂(zhi)(zhi)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)程度。我們使(shi)用這種(zhong)熒光方(fang)法從45種(zhong)藥(yao)物(wu)(wu)(wu)和10種(zhong)藥(yao)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)代謝物(wu)(wu)(wu)獲得的(de)(de)(de)(de)(de)(de)數據證明了(le)與人體研究(jiu)、體內測(ce)(ce)(ce)試和細胞分析報(bao)告的(de)(de)(de)(de)(de)(de)磷脂(zhi)(zhi)沉(chen)積癥有良好的(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)關(guan)性(xing)。因此，該測(ce)(ce)(ce)定(ding)提供(gong)了(le)一種(zhong)快速(su)、可(ke)靠且具有成本(ben)效益(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)篩選工具，用于早期預測(ce)(ce)(ce)候選藥(yao)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)磷脂(zhi)(zhi)沉(chen)積誘導潛力。

藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)誘(you)導(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)磷脂(zhi)(zhi)(zhi)病(PLD)，雖然(ran)(ran)(ran)不(bu)(bu)這么叫，但在(zai)(zai)(zai)1948年Nelson和(he)Fitzhugh首次(ci)報道(dao)了長期服用(yong)(yong)氯喹的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)大鼠(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)泡沫巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)胞。1后(hou)來(lai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)研究表(biao)明，陽離(li)子兩親(qin)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)（CADs)負責誘(you)導(dao)(dao)細(xi)(xi)胞中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)這種(zhong)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)積累(lei)，并導(dao)(dao)致存在(zai)(zai)(zai)主要(yao)成(cheng)分(fen)為(wei)溶(rong)酶體(ti)(ti)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)層(ceng)狀包(bao)涵體(ti)(ti)。2-5 PLD背后(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)機制(zhi)尚不(bu)(bu)完(wan)全清(qing)楚。兩個主要(yao)假設包(bao)括(kuo)(kuo)(i)CAD和(he)磷脂(zhi)(zhi)(zhi)之間通(tong)過疏水(shui)和(he)靜電(dian)相(xiang)互作用(yong)(yong)結合，導(dao)(dao)致溶(rong)酶體(ti)(ti)磷脂(zhi)(zhi)(zhi)酶無法(fa)消(xiao)化藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)復合物(wu)(wu)，以(yi)及(ii)CAD直接抑(yi)制(zhi)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)消(xiao)化酶。3，6-9沒有(you)明確的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)證據表(biao)明藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)誘(you)導(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)PLD與(yu)(yu)細(xi)(xi)胞毒性(xing)(xing)(xing)(xing)有(you)關。這種(zhong)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)儲(chu)存障礙(ai)被認為(wei)是(shi)細(xi)(xi)胞對(dui)CAD暴露的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)適應性(xing)(xing)(xing)(xing)反應10而(er)不(bu)(bu)是(shi)毒理學(xue)表(biao)現，并且(qie)在(zai)(zai)(zai)給藥(yao)(yao)(yao)終止后(hou)是(shi)可(ke)逆(ni)(ni)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)。11,12由PLD引起的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)代(dai)謝(xie)改變值得(de)關注(zhu)，因為(wei)它可(ke)能發生在(zai)(zai)(zai)包(bao)括(kuo)(kuo)肺、肝(gan)、腦(nao)、神經系統和(he)淋巴系統在(zai)(zai)(zai)內的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)一系列組織類型(xing)(xing)。13在(zai)(zai)(zai)某些情況下(xia)，它會(hui)導(dao)(dao)致藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)和(he)/或(huo)其代(dai)謝(xie)物(wu)(wu)在(zai)(zai)(zai)層(ceng)狀體(ti)(ti)中積累(lei)高(gao)(gao)達(da)毫摩爾濃(nong)度并導(dao)(dao)致細(xi)(xi)胞損傷(shang)。2,14因此(ci)，研究了化合物(wu)(wu)對(dui)PLD可(ke)逆(ni)(ni)性(xing)(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)程(cheng)度和(he)持續時間，以(yi)評(ping)估(gu)(gu)(gu)其安全范圍。在(zai)(zai)(zai)PLD的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)診斷中，需要(yao)通(tong)過透射電(dian)子顯微鏡(TEM)進(jin)行(xing)確認，這被廣泛接受為(wei)表(biao)征(zheng)(zheng)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)誘(you)導(dao)(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)沉(chen)積的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)標(biao)準方法(fa)。9,15-18在(zai)(zai)(zai)TEM下(xia)，巨(ju)噬(shi)細(xi)(xi)胞中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)洋蔥(cong)樣溶(rong)酶體(ti)(ti)是(shi)PLD的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)特征(zheng)(zheng)。然(ran)(ran)(ran)而(er)，由于TEM成(cheng)本高(gao)(gao)、需要(yao)犧牲實驗動(dong)物(wu)(wu)，以(yi)及研究與(yu)(yu)研究在(zai)(zai)(zai)實驗設計、劑量等方面的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)差異，TEM既不(bu)(bu)常見，也不(bu)(bu)容易滿足(zu)早期藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)發現和(he)開發的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)要(yao)求。已(yi)經開發了諸如(ru)計算(suan)機評(ping)估(gu)(gu)(gu)、體(ti)(ti)外生物(wu)(wu)篩選和(he)體(ti)(ti)內生物(wu)(wu)標(biao)志(zhi)物(wu)(wu)等工具來(lai)滿足(zu)藥(yao)(yao)(yao)物(wu)(wu)發現和(he)開發不(bu)(bu)同(tong)階(jie)段(duan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)需求，以(yi)預(yu)測(ce)或(huo)識別(bie)磷脂(zhi)(zhi)(zhi)質(zhi)沉(chen)積癥。由于CAD的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)特性(xing)(xing)(xing)(xing)，PLD的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)計算(suan)機模(mo)擬(ni)預(yu)測(ce)模(mo)型(xing)(xing)側重于篩選候選物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)親(qin)脂(zhi)(zhi)(zhi)性(xing)(xing)(xing)(xing)及其在(zai)(zai)(zai)中性(xing)(xing)(xing)(xing)13,19或(huo)較(jiao)低pH值下(xia)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)電(dian)荷，代(dai)表(biao)溶(rong)酶體(ti)(ti)中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)條件。20后(hou)來(lai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)模(mo)型(xing)(xing)還包(bao)含(han)詳細(xi)(xi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)化合物(wu)(wu)結構信息13或(huo)藥(yao)(yao)(yao)代(dai)動(dong)力學(xue)特性(xing)(xing)(xing)(xing)以(yi)提高(gao)(gao)可(ke)預(yu)測(ce)性(xing)(xing)(xing)(xing)。10雖然(ran)(ran)(ran)可(ke)用(yong)(yong)作第一層(ceng)標(biao)記(ji)工具，但計算(suan)機模(mo)型(xing)(xing)應謹(jin)慎使用(yong)(yong)，因為(wei)它們可(ke)能會(hui)投影PLD快照，尤其是(shi)對(dui)于虛(xu)擬(ni)分(fen)子，而(er)不(bu)(bu)是(shi)完(wan)整的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)機械評(ping)估(gu)(gu)(gu)，包(bao)括(kuo)(kuo)劑量依(yi)賴性(xing)(xing)(xing)(xing)和(he)時間依(yi)賴性(xing)(xing)(xing)(xing)。此(ci)外，這些工具無法(fa)預(yu)測(ce)非(fei)CAD誘(you)導(dao)(dao)劑，例如(ru)高(gao)(gao)度親(qin)水(shui)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)慶大霉素。21

圖1.用(yong)在不(bu)同檢測日期獲得(de)的不(bu)同測試(shi)物品的平均CMC說明檢測的重現性。誤差(cha)棒(bang)代(dai)表標準偏差(cha)。

在(zai)大多數制藥公司的PLD篩(shai)(shai)選(xuan)策(ce)略中，下一(yi)級篩(shai)(shai)選(xuan)分析(xi)是基(ji)(ji)于(yu)細胞(bao)的生物分析(xi)，在(zai)細胞(bao)內使用熒(ying)光脂(zhi)質或親脂(zhi)性(xing)染(ran)料(liao)。22-25最(zui)近報道了一(yi)種基(ji)(ji)于(yu)96孔的基(ji)(ji)因表(biao)達分析(xi)26；然(ran)而(er)，該測(ce)定已(yi)被證明不(bu)太敏感。22直到最(zui)近，還沒(mei)有基(ji)(ji)于(yu)非細胞(bao)的體外篩(shai)(shai)選(xuan)測(ce)定可用。已(yi)經(jing)報道了一(yi)種高(gao)通量langmuir-balance方(fang)法(fa)，將用測(ce)試化(hua)合物處理后臨(lin)界膠束濃度(CMC)的變(bian)化(hua)與在(zai)人(ren)類、動物和(he)細胞(bao)中觀(guan)察到的PLD聯系起來。27這(zhe)種方(fang)法(fa)大大提高(gao)了預測(ce)質量與計算(suan)模型(xing)相比(bi)，與細胞(bao)分析(xi)和(he)動物模型(xing)相比(bi)，增加(jia)了吞吐量；然(ran)而(er)，這(zhe)種方(fang)法(fa)需(xu)要使用專門的設備，即八(ba)通道表(biao)面張力計（Delta 8，Kibron Inc.，Helsinki，Finland），這(zhe)在(zai)大多數實驗室中并(bing)不(bu)容易獲(huo)得。

在本報告(gao)中，我們描述(shu)了一(yi)種(zhong)用(yong)于測定CMC的(de)替代方法，因此與langmuir平衡(heng)方法相一(yi)致，藥物的(de)磷脂生成潛力。我們使用(yong)熒光染(ran)料(liao)(liao)(liao)探針(zhen)通過短鏈(lian)脂質(zhi)的(de)CMC變化來測量(liang)藥物脂質(zhi)復(fu)合物的(de)形成。一(yi)些熒光染(ran)料(liao)(liao)(liao)探針(zhen)長期以來一(yi)直(zhi)用(yong)于測定CMC，28,29包括(kuo)脂質(zhi)30,31，這是(shi)(shi)基于影響染(ran)料(liao)(liao)(liao)探針(zhen)熒光發射的(de)膠束形成后(hou)的(de)微環境變化。所需的(de)儀(yi)器(qi)是(shi)(shi)大多數生物學和生物化學實驗室都有的(de)熒光讀板儀(yi)。

藥(yao)物(wu)代謝至少(shao)(shao)可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)通過兩(liang)種方式影響PLD。當形成(cheng)CAD的(de)極性代謝物(wu)時(shi)，它可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)迅速排出體外，從而減少(shao)(shao)母體積累(lei)的(de)可(ke)(ke)(ke)能性。另(ling)一(yi)方面，來(lai)自非(fei)CAD母體的(de)陽離子兩(liang)親代謝物(wu)的(de)形成(cheng)也可(ke)(ke)(ke)以(yi)(yi)誘導PLD。32這(zhe)種機制見解可(ke)(ke)(ke)能有助于解釋體外篩選(xuan)結果與體內動物(wu)數據(ju)之間的(de)脫節(jie)。出于這(zhe)個原因，我們還(huan)研究了一(yi)些(xie)測試(shi)化合(he)物(wu)的(de)主要代謝物(wu)的(de)磷脂(zhi)生(sheng)成(cheng)潛力。

Delta-8使用新方法測試CMC，而不是表面張力測試法——摘要

Delta-8使用新方法測試CMC，而不是表面張力測試法——方法

Delta-8使用新方法測試CMC，而不是表面張力測試法——結果

Delta-8使用新方法測試CMC，而不是表面張力測試法——討論