方法

設備和材(cai)料。設備。使用96孔(kong)熒光板讀數器（Sepctra Max-Gemini EM，Molecular Devices，Sunnyvale，CA）和96淺(qian)孔(kong)熒光板（Greiner Bio-one，Kremsmuenster，Austria）。

材料。用于(yu)驗證該方(fang)法的(de)所(suo)有標準化合物(wu)均購自Fisher Scientific/AG Scientific/Aldrich/Acros/Tocris/MP Biomedicals或從Novartis存儲庫獲得，無需進(jin)一步純化即(ji)可使(shi)用。

緩(huan)沖器。pH 7.2 N-2-羥(qian)乙(yi)基哌嗪(qin)-N0-2-乙(yi)磺酸(suan)(suan)(HEPES)緩(huan)沖液、20 mM含0.1 mM乙(yi)二胺四乙(yi)酸(suan)(suan)(EDTA)（MP biomedicals,Solon,OH）和pH 4.8乙(yi)酸(suan)(suan)緩(huan)沖液，使用40 mM。

熒光染料。NN-Dimethyl-6-propionyl-2-naphthylamine(Prodan)購自Fisher Scientific(Fair Lawn,NJ)。

陰離子脂質。1,2-Dioctanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine(sodium salt)(diC8PS)購自Avanti Polar Lipids Inc.(Alabaster,AL)。

樣(yang)品制備(bei)。測試化合物(wu)的儲備(bei)溶液(ye)。將(jiang)測試化合物(wu)以10、1或0.1 mM的濃度(du)溶解在(zai)(zai)二甲基(ji)亞砜(feng)(DMSO)中(zhong)。對于在(zai)(zai)上述(shu)濃度(du)下不能完全(quan)溶于DMSO的化合物(wu)如(ru)慶大霉素，則使用蒸餾水代替。

脂質(zhi)溶(rong)液(ye)。從(cong)Avanti購買的diC8PS氯仿中的50 mg/mL儲(chu)備溶(rong)液(ye)在(zai)氯仿/甲醇(chun)(5:1 v/v)中進一(yi)步(bu)稀釋，得到16 mg/mL的濃(nong)度，不(bu)使用(yong)時(shi)儲(chu)存在(zai)80°C。將4 mL該溶(rong)液(ye)轉(zhuan)移到一(yi)個干凈的20 mL玻璃小瓶中，并(bing)在(zai)溫和的氮氣流下蒸發溶(rong)劑(ji)。將干燥的脂質(zhi)膜分(fen)散在(zai)10 mL的20 mM HEPES緩沖(chong)液(ye)、0.1 mM EDTA、pH 7.2中，最終濃(nong)度為6 mg/mL。使用(yong)前將溶(rong)液(ye)劇烈渦旋，置于60℃水(shui)浴中孵(fu)育45分(fen)鐘。該溶(rong)液(ye)在(zai)不(bu)使用(yong)時(shi)儲(chu)存在(zai)4°C，然(ran)后在(zai)使用(yong)前用(yong)上述相同的HEPES緩沖(chong)液(ye)稀釋以(yi)獲得4和1 mg/mL溶(rong)液(ye)。染料溶(rong)液(ye)。Prodan溶(rong)解(jie)在(zai)甲醇(chun)中制(zhi)成0.3 mg/mL的儲(chu)備溶(rong)液(ye)。溶(rong)液(ye)的容器用(yong)箔包(bao)裹并(bing)在(zai)室溫下避光儲(chu)存。在(zai)加入樣品溶(rong)液(ye)之前，使用(yong)甲醇(chun)將溶(rong)液(ye)稀釋至(zhi)0.05 mg/mL。

圖2.在(zai)(zai)不同濃度的(de)脂(zhi)質(zhi)diC8PS下記錄(lu)的(de)熒光(guang)發射，范(fan)圍從(cong)64μg/mL到3.47 mg/mL。在(zai)(zai)對(dui)照中，添加(jia)純DMSO代替測試化合(he)物(O)，1.1 mg/mL的(de)急劇上升標志著diC8PS的(de)CMC。將(jiang)10μL的(de)10 mM硫利達(da)嗪(9)引入(ru)基質(zhi)（20 mM HEPES緩(huan)沖液中的(de)diC8PS），CMC轉(zhuan)移(yi)到較低濃度（0.042 mg/mL）。RFU：相(xiang)對(dui)熒光(guang)單位(wei)。

樣品(pin)板(ban)制(zhi)備和(he)(he)測量(liang)。通(tong)過(guo)(guo)混合10μL化合物(wu)儲備溶(rong)液(ye)（用于(yu)(yu)對照(zhao)的(de)(de)純DMSO）、10μL Prodan溶(rong)液(ye)和(he)(he)正確量(liang)的(de)(de)脂質(zhi)(zhi)溶(rong)液(ye)制(zhi)備樣品(pin)板(ban)，使(shi)最(zui)終脂質(zhi)(zhi)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)為(wei)3.3、2、1、0.8、0.5、0.25、0.1、0.08、0.06、0.006和(he)(he)0.0006 mg/mL，每(mei)孔(kong)總(zong)體(ti)積為(wei)110μL，通(tong)過(guo)(guo)添加緩(huan)沖(chong)溶(rong)液(ye)進行調整。來(lai)自10、1和(he)(he)0.1 mM DMSO儲備溶(rong)液(ye)的(de)(de)最(zui)終藥(yao)物(wu)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)分(fen)別為(wei)910、91和(he)(he)9.1μM。使(shi)用Spectra Max-Gemini EM讀板(ban)器讀取(qu)板(ban)，激發(fa)(fa)波長(chang)為(wei)360 nm，發(fa)(fa)射波長(chang)為(wei)430 nm。臨界膠束濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)的(de)(de)測定(ding)。將熒光(guang)讀數與脂質(zhi)(zhi)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)作圖(tu)。CMC被(bei)定(ding)義為(wei)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)點(dian)，高于(yu)(yu)該(gai)濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)點(dian)熒光(guang)信號的(de)(de)增(zeng)強是濃(nong)(nong)度(du)(du)(du)的(de)(de)函數，如圖(tu)1所(suo)示。雙相線性(xing)(xing)圖(tu)的(de)(de)截距由諾華IT開發(fa)(fa)的(de)(de)內部Microsoft Excel工(gong)作表自動確定(ding)。Microsoft Excel工(gong)作表通(tong)過(guo)(guo)從(cong)數據中(zhong)的(de)(de)點(dian)的(de)(de)移(yi)動窗口中(zhong)尋(xun)找最(zui)佳R2值來(lai)定(ding)位最(zui)適合垂(chui)(chui)直線性(xing)(xing)曲線的(de)(de)值。其(qi)余(yu)數據用于(yu)(yu)水平線性(xing)(xing)曲線。通(tong)過(guo)(guo)從(cong)垂(chui)(chui)直曲線中(zhong)減去(qu)水平曲線來(lai)計算截距點(dian)，即CMC值。對照(zhao)實驗中(zhong)的(de)(de)交點(dian)代表培養基基質(zhi)(zhi)中(zhong)脂質(zhi)(zhi)的(de)(de)CMC。

測(ce)定重現性。為了測(ce)試(shi)測(ce)定的(de)再(zai)現性，一(yi)些化合物在不同的(de)測(ce)定日期(qi)(qi)進行了多次測(ce)試(shi)。連同在每個測(ce)定日期(qi)(qi)運行的(de)對照數據，變(bian)異系(xi)數(CV)的(de)范(fan)圍為4%到8%，表明當前(qian)方法(fa)具有(you)良好(hao)的(de)重現性（圖1）。

Delta-8使用新方法測試CMC，而不是表面張力測試法——摘要

Delta-8使用新方法測試CMC，而不是表面張力測試法——方法

Delta-8使用新方法測試CMC，而不是表面張力測試法——結果

Delta-8使用新方法測試CMC，而不是表面張力測試法——討論