二、材料與方法

2.1. 材料

主要(yao)構(gou)成(cheng)重建膜外(wai)葉的(de)脂(zhi)質(zhi)購(gou)自(zi) Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA) 并按原樣使用。 化合物 1- 棕櫚酰-2-二十(shi)二碳六烯(xi)酰-sn-甘油-3-磷酸(suan)膽(dan)(dan)堿(jian) (PC (16:0/22:6), Mw = 806.1, 純(chun)度(du)(du) > 99%) 和(he)(he)(he) 1-(1Z-十(shi)八碳烯(xi)基)-2- 二十(shi)二碳六烯(xi)酰-sn-甘油-3-磷酸(suan)膽(dan)(dan)堿(jian) PC (P-18:0/22:6, Mw = 818.2，純(chun)度(du)(du) > 99%) 作為氯(lv)仿溶液 (10 mg mL-1) 獲(huo)得(de)。 PC (16:0/22:6) 和(he)(he)(he) 將 P-PC (18:0/22:6) 稀釋(shi)以(yi)獲(huo)得(de) 1.25 mg mL-1 溶液。 來(lai)自(zi)綿羊(yang)毛(mao)的(de)膽(dan)(dan)固醇(chun)（Chol，Mw = 711.0，純(chun)度(du)(du) > 98%）和(he)(he)(he) 來(lai)自(zi)雞蛋的(de)鞘磷脂(zhi)（SM，Mw = 386.7，純(chun)度(du)(du) > 98%） 以(yi)粉末形式獲(huo)得(de)。 兩者都溶于氯(lv)仿 （HPLC 級(ji)，Carlo Erba，Val de Reuil，法國）濃度(du)(du)為 1.25 毫(hao)克(ke)毫(hao)升-1。

冷(leng)凍保護培養基由 Trizma 堿(jian)組(zu)成(cheng) (173.0 mM)，檸檬酸一水(shui)合(he)物(wu) (70.0 mM)，果(guo)糖(tang) (56.0 mM)、甘(gan)油 (6.4%; v/v)，最后是抗生素(su)(su)（青霉(mei)素(su)(su) G 鈉 391 mg L?1，硫酸鏈霉(mei)素(su)(su) 856 mg L?1，林可霉(mei)素(su)(su) 鹽酸鹽 204 mg L?1，硫酸壯觀(guan)霉(mei)素(su)(su)四水(shui)合(he)物(wu) 585 mg L-1)（Sigma-Aldrich，St. Quentin Fallavier，法國）。 這 pH 值(zhi)調整為 6.2，其滲透壓約為 1300.0 摩爾(er)滲透壓。

2.2. 低密度脂蛋白的提取

從蛋(dan)(dan)黃中(zhong)提(ti)取低密(mi)度(du)脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai) (LDL) 根據(ju)穆薩等人的(de)(de)協議。 [31]。 提(ti)取后，LDLs 的(de)(de)濃縮(suo)提(ti)取物（22 ± 0.5 g 相當于(yu) 8.36 g 干 LDL）在(zai)冷(leng)凍(dong)保護培養基中(zhong)稀釋 (100 毫(hao)(hao)(hao)升)。 低密(mi)度(du)脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)樣(yang)品(pin)中(zhong)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質的(de)(de)定量(liang) 微 BCA 蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質測定試劑盒（Pierce，Thermoscientific，法(fa)國(guo)）提(ti)供 8.9 ± 1.0 毫(hao)(hao)(hao)克(ke)毫(hao)(hao)(hao)升-1。 低密(mi)度(du)脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)樣(yang)品(pin)中(zhong) PC 磷(lin)脂(zhi)(zhi)的(de)(de)含量(liang) 由雞蛋(dan)(dan)中(zhong) PC 的(de)(de)自然比例計算得出（18.4 g PC/100 g ofdry LDLs) 由 Antonet al. [33] 給出。它等于(yu) 15.4 g L?1 LDLs 樣(yang)本。 低密(mi)度(du)脂(zhi)(zhi)蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)還(huan)包(bao)含一小部分 PE (PC/PE 6:1) [33]。

2.3. 收集血漿精液

牛(niu)精(jing)子是從一頭 Prim Holstein 公牛(niu)身(shen)上收(shou)集的(de)，并且 立即以(yi) 10,000 × g 離心兩(liang)次以(yi)回收(shou)精(jing)液 上清液中(zhong)的(de)血漿。 我們樣品(pin)的(de)蛋白質含量 是 88.5 ± 5.0 mg mL-1，由微 BCA 蛋白確定(ding) 檢測(ce)試劑盒（Pierce，Thermoscientific，法國）。

2.4. 脂質體的制備

脂質(zhi)體(ti)由(you)卵磷(lin)脂的(de)提取物(wu)(wu)制成 使用迷你擠(ji)出(chu)機通過擠(ji)出(chu)在冷(leng)凍保護(hu)緩(huan)沖(chong)(chong)液中 來(lai)自 Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, USA)。 的(de)提取物(wu)(wu) 卵磷(lin)脂由(you)磷(lin)脂酰膽堿 (73%) 和(he)(he)(he) 磷(lin)脂酰乙醇胺 (11%) 和(he)(he)(he)少量(liang)成分(fen)(fen)，包括甘(gan)油三酯和(he)(he)(he)鞘磷(lin)脂。 提取物(wu)(wu)在 冷(leng)凍保護(hu)緩(huan)沖(chong)(chong)液在脂質(zhi)濃度(du)(du)為 分(fen)(fen)別為 3.90 mg mL-1 (C1)、7.28 mg mL-1 (C2)、14.56 mg mL-1 (C3) 和(he)(he)(he) 21.84 mg mL-1 (C4)。 然(ran)后(hou)對分(fen)(fen)散(san)(san)液進行超聲處(chu)理 在超聲波浴（來(lai)自德國辛(xin)根 Elma 的(de) Elmasonic S 30H，功(gong)率為 275W）中持續 15 分(fen)(fen)鐘(zhong)。 最(zui)后(hou)，分(fen)(fen)散(san)(san)是 在擠(ji)出(chu)機中擠(ji)出(chu)（20 次通過 100 nm 膜）。 分(fen)(fen)布尺(chi)寸以 120 nm 為中心(xin)，Zeta 電位 值為 -6 mV。 在 BSP 存在下引(yin)入(ru)的(de)脂質(zhi)體(ti)量(liang)以重量(liang)表示（1.17 mg、2.18 mg、4.37 mg 和(he)(he)(he) 6.55 mg 脂質(zhi)，用于脂質(zhi)體(ti)分(fen)(fen)散(san)(san)體(ti) C1、C2、C3 和(he)(he)(he) C4 分(fen)(fen)別）。 不確定(ding)度(du)(du)為 0.01 毫克。

2.5. 電泳

十二烷基硫酸鈉聚(ju)丙烯(xi)酰胺凝(ning)膠電(dian)泳 (SDS-PAGE) 在(zai)(zai)還原條件下進行(xing)。 開(kai)創性的(de) 將(jiang)血漿溶(rong)解在(zai)(zai)由(you) Tris 0.5 M 組成的(de) pH 6.8 緩(huan)(huan)沖液中， SDS 10%、甘(gan)油 30% w/w 和溴酚藍(lan) 0.4% 得到 1 mg mL-1 溶(rong)液。 9% 巰基乙醇 v/v 是 加(jia)入樣(yang)品，渦旋混合，隨后(hou)加(jia)熱至 95°C 5 分鐘。 那么，10 ? L 低范圍分子量 標準（來自 Euromedex、Souffelweyersheim、 法(fa)國) 和 10 到 25 ? L 精漿裝載在(zai)(zai) 15%- 聚(ju)丙烯(xi)酰胺凝(ning)膠（pH 6.8-Tris 0.5 M 和 SDS 0.10%）偶聯 使用由(you) Tris 0.025 M、甘(gan)氨(an)酸組成的(de) pH 8.3 遷移緩(huan)(huan)沖液 0.192 M，SDS 0.1%。 電(dian)泳在(zai)(zai) 20 mA 下進行(xing)， 凝(ning)膠用考馬斯藍(lan) G250 溶(rong)液染(ran)色(se)。 染(ran)色(se)的(de) 最(zui)后(hou)掃描凝(ning)膠并評估峰的(de)強(qiang)度 通過 Multi Gauge 軟件（2.0 版(ban)，Fuji Photo Film Co., Ltd.， 日(ri)本(ben)）。

2.6. 表面活性測量

測(ce)量吉布斯膜（通過從精(jing)漿溶液擴散到空(kong)氣-緩沖液界面(mian)而形成）的表面(mian)張力 在(zai) 15 孔(kong)板（鋁底(di)多孔(kong)板，帶有 Teflon 輪輞）安裝(zhuang)在(zai)朗繆爾(er)天平(ping)（微槽 XL-LB，Kibron Inc., Helsinki, Finland）配備高靈敏度傳感器（使用(yong)合(he)金線(xian)的威廉米法）。 該設備被(bei)放置(zhi)在(zai)一(yi)個 溫度控制區(qu)域固定在(zai) 23°C，并用(yong)純(chun)蒸餾水(shui)校準（Milli-Q 系(xi)統，Millipore，美國）。 測(ce)量精(jing)度為 0.1 mN/m。 精(jing)漿被(bei)放置(zhi)在(zai) 第一(yi)個孔(kong)然后在(zai)下一(yi)個孔(kong)中稀釋 2 倍，依此類推(tui)（每(mei)個 井的體(ti)積(ji)為 300 ? L)。 重復測(ce)量 每(mei)種精(jing)漿提取物 4 次 (n = 2)。 結(jie)果是 表示為所有測(ce)量值的平(ping)均值。

在配備傳感(gan)器的先前(qian)朗繆爾槽(cao)上測量蛋(dan)白質膜的壓縮(suo)等(deng)(deng)溫(wen)線 （微槽(cao) XL-LB，Kibron Inc.，赫爾辛基，芬蘭）。 開創性的 血漿首(shou)先在冷(leng)凍保存的緩(huan)沖液中稀釋（1/100） 并在緩(huan)沖液表面逐滴(di)（50 升）展(zhan)開。 這 在平(ping)衡(heng) 20 分鐘后(hou)和在室溫(wen) (23°C) 下(xia)記錄壓縮(suo)等(deng)(deng)溫(wen)線。

2.7. 外葉脂質結構域的重建 精子膜

精子外葉(xie)的(de)(de)(de)(de)脂(zhi)(zhi)質(zhi)結(jie)構域 如前(qian)所述(shu)[35]重建膜。 這 Langmuir 槽 (302LL, Nima Technology, UK) 被(bei)插入一(yi)個 自(zi)制(zhi)手套箱放在(zai)(zai)(zai)防震臺上并沖洗(xi) 用(yong)氬(ya)氣防止脂(zhi)(zhi)質(zhi)氧化(hua)。 測量(liang)表面(mian)壓(ya)(ya)(ya)(ya)力(li)(li) 使用(yong)由過(guo)濾器(qi)制(zhi)成的(de)(de)(de)(de) Wilhelmy 板，精度(du)(du)為(wei) 0.1 mN/m 紙(zhi)（Whatman 的(de)(de)(de)(de)無灰(hui) Whatman 色譜紙(zhi)） International Ltd., Maidstone, Kent, UK) 連接到(dao)(dao)一(yi)個電 平(ping)(ping)衡。 環境溫(wen)度(du)(du)固(gu)定(ding)在(zai)(zai)(zai) 20℃。 所有(you)燒(shao)瓶 和注(zhu)射器(qi)被(bei)引入手套箱，然后 在(zai)(zai)(zai)鋪展單層(ceng)之(zhi)前(qian)用(yong)氬(ya)氣脫氣 1 小時。 朗繆(mou)爾(er)(er)天平(ping)(ping)的(de)(de)(de)(de)溫(wen)度(du)(du)是(shi)恒(heng)溫(wen)控制(zhi)的(de)(de)(de)(de) 通過(guo)設置在(zai)(zai)(zai) 40 ℃ 的(de)(de)(de)(de)循環水系統(tong)。 真實溫(wen)度(du)(du) 緩(huan)沖液表面(mian)的(de)(de)(de)(de)溫(wen)度(du)(du)為(wei) 34°C。 子階段包(bao)括 冷凍保護介質(zhi)。 膽(dan)固(gu)醇(chun)、鞘磷脂(zhi)(zhi)、P-PC (18:0/22:6) 和 PC (16:0/22:6) 的(de)(de)(de)(de)氯(lv)仿溶液 適當的(de)(de)(de)(de)摩(mo)爾(er)(er)比(bi)（31:14:16:39）逐滴展開 到(dao)(dao)緩(huan)沖子階段 25 ? L 微量(liang)注(zhu)射器(qi)（精確到(dao)(dao) 0.5 ? L)（Hamilton Bonaduz AG，Bonaduz，瑞士）。 在(zai)(zai)(zai)壓(ya)(ya)(ya)(ya)縮之(zhi)前(qian)，讓單層(ceng)平(ping)(ping)衡 10 分鐘 以 40 cm2/min 的(de)(de)(de)(de)屏(ping)障(zhang)速度(du)(du)啟動(dong)。 一(yi)旦(dan)達(da)到(dao)(dao)目標(biao)壓(ya)(ya)(ya)(ya)力(li)(li) (25 mN/m)，壓(ya)(ya)(ya)(ya)力(li)(li)就會保持(chi)不(bu)變 通過(guo)使用(yong)可移動(dong)障(zhang)礙(ai)物調整(zheng)表面(mian)積來(lai)保持(chi)恒(heng)定(ding)。 由于(yu)單層(ceng)在(zai)(zai)(zai) 30 mN/m 下隨時間不(bu)夠穩定(ding) 這是(shi)與(yu)脂(zhi)(zhi)質(zhi)堆積密(mi)度(du)(du)相關的(de)(de)(de)(de)薄膜壓(ya)(ya)(ya)(ya)力(li)(li) 雙層(ceng) [36]，我們將目標(biao)壓(ya)(ya)(ya)(ya)力(li)(li)降(jiang)低到(dao)(dao) 25 mN/m，其中 單層(ceng)更穩定(ding)（見(jian)結(jie)果）。

一旦達到(dao)目標壓(ya)力 (25 mN/m)， 在引入(ru)(ru)解決方案之前保持 1000 s 生(sheng)(sheng)物(wu)分子(zi)（低(di)密度脂(zhi)蛋(dan)白、BSP 或脂(zhi)質(zhi)(zhi)體）進入(ru)(ru)亞(ya)相 彎針注射器。 針遠離尖端彎曲 躺在槽(cao)的(de)(de)底部，以便注射 在壓(ya)縮(suo)亞(ya)相之下執行。 等量的(de)(de)體積(ji)（每種(zhong)添加劑 0.3 毫升）之前被(bei)移除 障礙(ai)。 注入(ru)(ru)生(sheng)(sheng)物(wu)分子(zi)后，面(mian)積(ji)變化 監測(ce)每個脂(zhi)質(zhi)(zhi)分子(zi)并(bing)表(biao)示為變化 相對于(yu)初始值 (A/A= (A?A(t0)) × 100/A(t0))。 它有 被(bei)跟蹤了 3000 秒，時間對應于(yu)處理 冷凍保存前的(de)(de)精液。 在這種(zhong)恒壓(ya)模式下， 生(sheng)(sheng)物(wu)分子(zi)插入(ru)(ru)脂(zhi)質(zhi)(zhi)單層導致(zhi) 通過增加而降低(di)的(de)(de)薄膜壓(ya)力的(de)(de)增加 表(biao)面(mian)積(ji)。 反(fan)之，表(biao)面(mian)積(ji)減少(shao) 生(sheng)(sheng)物(wu)分子(zi)導致(zhi)脂(zhi)質(zhi)(zhi)單層溶解在亞(ya)相中。 重(zhong)復所有數據，偏差不超過5% 的(de)(de)表(biao)面(mian)積(ji)。

圖 1. 從牛精液中(zhong)分離的(de)精漿的(de) SDS-PAGE 凝膠(jiao)和 以不(bu)同濃度沉積：泳道(dao)(dao) 1:1 ? G; 車道(dao)(dao) 2:2 ? G; 車道(dao)(dao) 3:5 ? g和車道(dao)(dao) 4:10？ G。

2.8. 低溫透射電子顯微鏡 (cryo-TEM)

使用(yong)cryoplunge冷凍(dong)固定裝(zhuang)置(zhi)（Gatan，USA）制備冷凍(dong)TEM觀(guan)察標(biao)(biao)本(ben)，其中(zhong)一滴 將水懸浮液(ye)(ye)沉積在(zai)輝(hui)光(guang)放電的(de)多孔型碳涂(tu)層(ceng)網格(ge)（Ted Pella Inc.，美國）上(shang)。 TEM 網格(ge)是(shi) 然后通過吸干含有樣(yang)品的(de)液(ye)(ye)滴來(lai)制備 支撐碳膜中(zhong)的(de)孔中(zhong)保留(liu)有薄薄的(de)液(ye)(ye)體層(ceng)。 通過快(kuai)速插入(ru)網格(ge)使液(ye)(ye)膜玻(bo)(bo)璃化(hua)(hua) 轉化(hua)(hua)為由(you)液(ye)(ye)氮冷卻(que)的(de)液(ye)(ye)態(tai)乙烷。 玻(bo)(bo)璃化(hua)(hua)標(biao)(biao)本(ben)安裝(zhuang)在(zai) Gatan 910 標(biao)(biao)本(ben)架（Gatan，美國） 使用(yong) CT-3500-cryotransfer 插入(ru)顯微鏡 系統（Gatan，美國）并用(yong)液(ye)(ye)氮冷卻(que)。 透(tou)射電鏡圖(tu)像 然后從(cong)保存在(zai)玻(bo)(bo)璃冰中(zhong)的(de)標(biao)(biao)本(ben)中(zhong)獲得 懸浮在(zai)支撐碳基板上(shang)的(de)孔中(zhong)。

在(zai)(zai)低劑量條件下(xia)觀察樣(yang)品 (<10 e-/A2)，-178 ℃，使(shi)用 JEM 1230 'Cryo' 顯微(wei)鏡（Jeol， Japan) 在(zai)(zai) 80 kV 下(xia)運行并配備了(le)(le) LaB6 燈(deng)絲。 全部 顯微(wei)照(zhao)片記(ji)錄在(zai)(zai) Gatan 1.35K × 1.04K × 12 位(wei) ES500W CCD 相機。 采集了(le)(le) 50 多張圖像系(xi)列 對于來自(zi)多個(ge)樣(yang)品制備的每個(ge)樣(yang)品，具有不同的 放大倍數，以確(que)保觀察的良好重復(fu)性(xing)。

應用不同組裝的磷脂酰膽堿對牛精漿蛋白的隔離——摘要、簡介

應用不同組裝的磷脂酰膽堿對牛精漿蛋白的隔離——材料與方法

應用不同組裝的磷脂酰膽堿對牛精漿蛋白的隔離——結果與討論

應用不同組裝的磷脂酰膽堿對牛精漿蛋白的隔離——結論、致謝！